การพัฒนาเทคนิคทางดีเอ็นเอเพื่อการตรวจหาเชื้อ Fusarium oxysporum f.sp. cubense สาเหตุของโรคตายพรายกล้วย

Development of DNA-based techniques for detection of Fusarium oxysporum f.sp. cubense, the causal agent of panama disease

Name: นงค์นิด พระไชยบุญ

ThaSH: มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ -- วิทยานิพนธ์. วท.ม. (ทรัพยากรเกษตร) 2564

Classification :.LCCS: SB608.B16

ThaSH: มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์. สาขาทรัพยากรเกษตร -- วิทยานิพนธ์

ThaSH: กล้วย -- โรคและศัตรูพืช

ThaSH: ฟูซาเรียมออกซิสปอรัม

ThaSH: Fusarium wilt of banana

ThaSH: โรคตายพรายกล้วย

Abstract: Fusarium oxysporum f.sp. cubense (Foc) เป็นเชื้อราสาเหตุของโรคตายพรายกล้วย สามารถติดไปกับหน่อพันธุ์และทำให้เกิดการระบาดในแปลงใหม่ได้ การตรวจหาเชื้อรา Foc จากหน่อพันธุ์ช่วยให้เกษตรกรสามารถป้องกันการระบาดของโรคนี้ได้ วิทยานิพนธ์นี้มีวัตถุประสงค์เพื่อพัฒนาเทคนิค nested PCR และ real-time PCR ในการตรวจหา Foc การพัฒนาวิธีการตรวจด้วยเทคนิค nested PCR โดยการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอเป้าหมายด้วยเทคนิค PCR 2 ครั้ง ครั้งแรกใช้ไพรเมอร์ W1805F และ W1805R (Li และคณะ, 2012) จากนั้นนำผลิตภัณฑ์ PCR ที่ได้มาเป็นต้นแบบสำหรับทำ PCR ครั้งที่ 2 โดยใช้ไพรเมอร์ W18051F3 และ W18051B3 ที่ออกแบบให้มีตำแหน่งคู่สมอยู่ระหว่างคู่ไพรเมอร์ของ PCR ครั้งแรก จากผลการประเมินประสิทธิภาพของการตรวจหาเชื้อเป้าหมาย พบว่า เทคนิค nested PCR มีความจำเพาะเจาะจงต่อการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอเป้าหมายจากเชื้อรา Foc ไม่พบการเพิ่มปริมาณในเชื้อราอื่นรวมถึงแบคทีเรียในดิน เมื่อประเมินความไวในการตรวจหาพบว่า สามารถตรวจหาดีเอ็นเอเป้าหมายได้ต่ำสุดที่ 100 copy การพัฒนาวิธีการตรวจด้วยเทคนิค real-time PCR โดยการนำลำดับนิวคลีโอไทด์บางส่วนของยีน EF1α, IGS, RPB1, RPB2 และ ITS มาออกแบบไพรเมอร์พบว่าลำดับนิวคลีโอไทด์ RPB1 มีความแตกต่างจากเชื้อใน Fusarium spp. อื่น ๆ และสามารถนำมาใช้ในการออกแบบไพรเมอร์ได้ จากผลการประเมินประสิทธิภาพของการตรวจหาเชื้อเป้าหมาย พบว่าเทคนิค real-time PCR มีความจำเพาะเจาะจงต่อการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเป้าหมายจากเชื้อรา Foc ไม่พบการเพิ่มปริมาณในเชื้อราและแบคทีเรียที่คัดแยกได้จากดิน เมื่อประเมินความไวในการตรวจหาพบว่า สามารถตรวจหาดีเอ็นเอเป้าหมายได้ต่ำสุดที่ 1000 copy เมื่อเปรียบเทียบประสิทธิภาพในการตรวจหาดีเอ็นเอเป้าหมายระหว่างเทคนิค nested PCR และ real-time PCR พบว่าทั้ง 2 เทคนิค ตรวจได้เมื่อใช้ดีเอ็นเอของเชื้อรา Foc ต่ำสุดที่ 5 pg เมื่อนำเทคนิคที่พัฒนาได้มาตรวจหาเชื้อ Foc ในหน่อกล้วยที่ไม่แสดงอาการโรคจากต้นแม่ที่เป็นโรค พบว่าเทคนิค PCR ไม่สามารถตรวจหาเชื้อเป้าหมายได้ ในขณะที่ nested PCR และ real-time PCR สามารถตรวจหาเชื้อเป้าหมายได้ วิธีตรวจหาเชื้อเป้าหมายด้วยเทคนิค nested PCR และ real-time PCR ที่พัฒนาจากการศึกษาในครั้งนี้สามารถนำไปใช้คัดเลือกหน่อพันธุ์กล้วยที่ปลอดจากโรคและช่วยลดการแพร่ระบาดและการกระจายตัวของโรคตายพรายได้ Fusarium oxysporum f.sp. cubense (Foc) is a causal agent of Panama disease in Banana. This pathogen can spread to banana plantation through infected suckers. Protecting banana from this disease can be done via disease quarantine by using qualified detection method. This thesis aimed to develop nested PCR and real-time PCR technique to detect Foc. Foc detection by nested PCR was performed by amplifying target DNA by PCR technique which is complete into two steps, 1st and 2nd round PCR. The PCR product from the 1st round PCR (primary PCR) used primers W1805F and W1805R (Li et al., 2012) were used to be template for the 2nd round PCR. Primers for the 2nd round PCR, W18051F3 and W18051B3, were designed and their complementary sites were inside the 1st round PCR product. The results showed that the nested PCR was specific to Foc. There was no amplification found in other fungi and soil bacteria. Nested PCR technique was able to detect the target DNA with a minimum of 100 copies. To develop real-time PCR technique, nucleotide sequences of five genes including EF1α, IGS, RPB1, RPB2 and ITS were analyzed for primer design. Only RPB1 sequence was different from other Fusarium spp. then this sequence was used to design specific primers. The results showed that the designed primers were specific to Foc. There was no amplification found in other fungi and soil bacteria. The real-time PCR technique was able to detect the target DNA with a minimum of 1000 copies. The comparison of sensitivity between nested PCR and realtime PCR to detect Foc DNA, showed that both techniques could detect up to 5 pg of Foc DNA. Moreover, the ability of the developed detection techniques to detect Foc in symptomless banana sucker were compared with standard PCR. The result showed that PCR technique was not able to detect the pathogen. In contrast, nested PCR and real-time PCR technique had ability to detect symptomless sucker. Foc detection using nested PCR and real time PCR technique can be a promising tool for disease free sucker selection to reduce disease spread in banana plantation.

มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์. สำนักหอสมุด

Address: กรุงเทพมหานคร

Email: tdckulib@ku.ac.th

Name: ประภาษ กาวิชา

Role: อาจารย์ที่ปรึกษาวิทยานิพนธ์หลัก

Created: 2564

Modified: 2568-07-02

Issued: 2568-07-02

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

URL: https://www.lib.ku.ac.th/KUthesis/2564/nongnid-pra-all.pdf

CallNumber: SB608.B16 .น12

tha

DegreeName: วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต

Level: ปริญญาโท

Descipline: ทรัพยากรเกษตร

Grantor: มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์

©copyrights มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	nongnid-pra-all.pdf	3.7 MB

ใช้เวลา

0.023081 วินาที