การหาสภาวะที่เหมาะสมของการผลิตเอนไซม์อินูลิเนสและอินเวอร์เทสจากยีสต์ Candida guilliermondii TISTR 5844 และเชื้อรา Aspergillus niger TISTR 3570 และการคัดแปลงพันธุกรรมของยีสต์ Pichia pastoris GS115

Optimization of inulinase and invertase production from Candida guilliermondii TISTR 5844 and Aspergillus niger TISTR 3570 and genetic modification of Pichia pastoris GS115

Name: มลนพรรษ สงค์พิมพ์

ThaSH: มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ -- วิทยานิพนธ์. ปร.ด. (เทคโนโลยีชีวภาพ) 2560

Classification :.LCCS: TP248.65.E59

ThaSH: มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์. สาขาเทคโนโลยีชีวภาพ -- วิทยานิพนธ์

ThaSH: เอนไซม์จุลินทรีย์

ThaSH: อินูลิน

ThaSH: ยีสต์

ThaSH: แอสเปอร์จิลลัส ไนเจอร์

Abstract: Aspergillus nigerTISTR 3570 และ Candida guilliermondii TISTR 5844 ซึ่งคัดแยกจากหัวเยรูซาเล็มอาร์ทิโช้ค สามารถผลิต เอนไซม์อินูลิเนส อินเวอร์เทส และบีตา-ฟรักโทฟิวราโนซิเดส (bFFase) ได้เป็นอย่างดีงานวิจัยนี้จึงศึกษาสภาวะที่เหมาะสมของการ ผลิตเอนไซม์ หาสภาวะการทํางานของเอนไซม์ในถังปฏิกรณ์เอนไซม์ และการเพิ่มประสิทธิภาพการผลิตเอนไซม์เอนโดอินูลิเนสจากเชื้อรา A.nigerTISTR 3570 โดยการดัดแปลงยีนในยีสต์ Pichia pastoris GS115 ปัจจัยที่มีอิทธิพลต่อการผลิตเอนไซม์อินเวอร์เทสด้วยยีสต์ C. guilliermondii TISTR 5844ได้แก่ พีเอชและอุณหภูมิ (R2= 0.822 และ p < 0.05) แต่ปัจจัยทั้งสองไม่มีอิทธิพลต่อการผลิตเอนไซม์อินูลิเนสโดยมีแหล่งคาร์บอนและไนโตรเจนที่เหมาะสม ได้แก่ อินูลิน และแอมโมเนียมคลอไรด์ตามลําดับ เมื่อศึกษาองค์ประกอบของอาหารเพาะเลี้ยงที่เหมาะสมต่อการผลิตเอนไซม์อินูลิเนส และอินเวอร์เทสโดยวิธีทะกุจิ ได้สภาวะที่เหมาะสมต่อการผลิตเอนไซม์อินูลิเนส (56.41 หน่วย/ลิตร) ที่ความเข้มข้นเริ่มต้นของอินูลิน 1% แอมโมเนียมคลอไรด์ 2.4% แมกนีเซียมซัลเฟต 1.2% และพีเอช 5 และสภาวะที่เหมาะสมต่อการผลิตเอนไซม์อินเวอร์เทส (552.12 หน่วย/ลิตร) ที่ความเข้มข้นเริ่มต้นของอินูลิน 5% แอมโมเนียมคลอไรด์ 4.8% แมกนีเซียมซัลเฟต 1.2% และพีเอช 6 สําหรับองค์ประกอบของอาหารเพาะเลี้ยงที่เหมาะสมต่อการผลิตเอนไซม์อินูลิเนส อินเวอร์เทส และ bFFase ด้วยเชื้อรา A. nigerTISTR 3570 ได้แก่ ความเข้มข้นเริ่มต้นของอินูลิน 5% ยีสต์สกัด 1.2% แมกนีเซียมซัลเฟต 0.6% และพีเอช6 ซึ่งเอนไซม์ที่ผลิตจากเชื้อรามีความเสถียรที่ช่วงอุณหภูมิสูง (25–80ºC) โดยมีกิจกรรมเอนไซม์อินูลิเนสอินเวอร์เทสและ bFFase สูงสุดที่อุณหภูมิ 70ºC 65ºC และ 60ºC ตามลำดับ แต่เอนไซม์อินเวอร์เทสและ bFFase มีความเสถียรของเอนไซม์ที่อุณหภูมิเท่ากับ 55ºC และ 50ºC ตามลำดับ โดยเอนไซม์อินูลิเนสมีความเสถียรที่พีเอช4–10 แต่เอนไซม์อินเวอร์เทสและ bFFase มีความเสถียรที่พีเอช4–9 ซึ่งเอนไซม์อินูลิเนสและ bFFase มีกิจกรรมสูงสุดที่พีเอช 5 และเอนไซม์อินเวอร์เทสมีกิจกรรมสูงสุดที่พีเอช 4 การเพิ่มประสิทธิภาพของการผลิตเอนไซม์ในถังปฏิกรณ์ชีวภาพภายใต้สภาวะที่มีความเสถียรของอุณหภูมิและพีเอช โดยการพัฒนาแบบจำลองทางคณิตศาสตร์อธิบายความเสถียรและกิจกรรมของเอนไซม์จากเชื้อรา A. nigerTISTR 3570 เพื่อหาสภาวะที่เหมาะสมต่อกิจกรรมและความเสถียรของเอนไซม์และครึ่งชีวิตของเอนไซม์ซึ่งได้ทํานายอุณหภูมิที่เหมาะสมของต่อกิจกรรมเอนไซม์อินูลิเนสและ อินเวอร์เทสเท่ากับ 39oC โดยมีครึ่งชีวิตของเอนไซม์อินูลิเนสและอินเวอร์เทสเท่ากับ 145.0 นาที และ1,108.6 นาที ตามลำดับ และอุณหภูมิที่เหมาะสมต่อกิจกรรมเอนไซม์ bFFase เท่ากับ 42oC โดยมีครึ่งชีวิตของเอนไซม์ bFFase เท่ากับ 690.4 นาที และได้ทำนายพีเอชที่เหมาะสมต่อกิจกรรมเอนไซม์อินูลิเนส อินเวอร์เทส และ bFFase เท่ากับ 5.4 4.9 และ 5.6 โดยมีครึ่งชีวิตของเอนไซม์ทั้งสามเท่ากับ 58.7283.4 และ 908.5 นาที ตามลำดับ สำหรับการปรับปรุงการผลิตเอนไซม์อินูลิเนส โดยการโคลนยีนเอนโดอินูลิเนสจากเชื้อรา A. nigerTISTR 3570 ให้แสดงออกในยีสต์ Pichia pastoris GS115 อาศัยโปรโมเตอร์ GAP ได้ยีสต์รีคอมบิแนนต์หมายเลข 26 ที่ผลิตเอนไซม์เอนโดอินูลิเนสที่มีกิจกรรมเอนไซม์ สูงสุดเท่ากับ 714.40 หน่วย/ลิตรกิจกรรมเอนไซม์จำเพาะเท่ากับ 2,542.99 หน่วย/กรัมโปรตีน และอัตราการผลิตเอนไซม์เท่ากับ 117.96 หน่วย/ลิตรชั่วโมงภายใต้สภาวะการเจริญต่ำของยีสต์ ในอาหารเพาะเลี้ยง YPD ที่มีกลูโคส 2% ที่อุณหภูมิ 30oC และความเร็วรอบ 250 รอบ/นาที ระยะเวลาเพาะเลี้ยง 6 ชั่วโมง ได้คอมบิแนนต์เอนโดอินูลิเนสที่มีสมบัติของพีเอชและอุณหภูมิที่เหมาะสมเท่ากับ 7 และ 30oC ตามลำดับ และความเสถียรของพีเอช 7–8 และความเสถียรของอุณหภูมิ 30–40oC การดัดแปลงพันธุกรรมยีสต์โดยอาศัยโปรโมเตอร์ GAP สามารถเพิ่มประสิทธิภาพของการผลิตเอนไซม์เอนโดอินูลิเนสได้ Aspergillus nigerTISTR 3570 and Candida guilliermondii TISTR 5844, previously isolated from Jerusalem artichoke tuber, were found to be good producers of inulinases, invertase and ß-fructofuranosidase (bFFase). Thus, the aim of this study was focused on optimization of these enzymes production, optimal enzyme reactor design, and improvement of endo-inulinase from A. nigerTISTR 3570 by genetic modification. The optimization of inulinases and invertase production from C. guilliermondii TISTR 5844 was studied. The most significant factors influencing invertase production were pH and temperature (R2= 0.822, p < 0.05), but these two factors were not significantly influenced on inulinase production. The best carbon and nitrogen sources for enzymes production were inulin and NH4Cl, respectively. Then, the medium composition was optimized by Taguchi method. Optimal medium composition for producing inulinases (56.41 U/L) were 1% inulin, 2.4% NH4Cl and 1.2% MgSO4·7H2O with initial pH 5, whereas the production of invertase (552.12 U/L) was maximized with the medium containing 5% inulin, 4.8% NH4Cl, 1.2% MgSO4·7H2O with initial pH 6. Also, inulinase, invertase and bFFase produced byA. nigerTISTR 3570 were maximized with the medium containing 5% inulin, 1.2% yeast extract, 0.6% MgSO4·7H2O with initial pH 6. Additionally, the fungal enzymes were found thermostable over a wide range of temperature (25–80ºC). The activities of inulinases, invertase and bFFase from A. nigerTISTR 3570 were highest at 70 65 and 60ºC, respectively. However, the stability of invertase and bFFase were below 55 and 50ºC. On the other hand, inulinase activity was stable over the range of pH 4–10, while the activities of invertase and bFFase were stable over the pH range at 4–9. Whereasthe activities of inulinase and bFFase were optimal at pH 5, and the activity of invertase was optimal at pH 4. The practical use of enzyme reactions is preferable to stabilize the enzymesat lower temperature. Thus, the mathematical modeling of stability and activity of the crude mixed enzyme from A. nigerTISTR 3570was developed. The observations revealed the optimal activity and stability of enzymes, as well as the enzyme processing time (half-life). From the predictions, an optimal temperature for inulinases and invertase activities was 39oC, resulting in their half-life of 145.0 and 1,108.6 min, respectively. An optimal temperature for bFFaseactivity was predicted at 42oC with 690.4-min half-life. For the optimal pH of inulinase, invertase and bFFase activity, pH 5.4, 4.9 and 5.6were obtained with 58.7-min, 283.4-min and 908.5-minhalf-life, respectively. Alternatively, the endo-inulinase from A. nigerTISTR 3570was improved by gene overexpression in Pichia pastoris GS115 using the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAP) promoter.The transformed yeast NO.26 was shown the highest endo-inulinase activity at 714.40 U/L. The specific activity (2,542.99 U/g protein) and productivity (117.96 U/Lh) were obtained under low cell growth rate, which cultured in YPD mediumcontaining 2% glucoseat 30oC on a rotary shaker with 250-rpm agitation for 6 h. The optimal pH and temperature of the recombinant endo-inulinase were pH 7 and 30ºC, respectively. Furthermore, therecombinant endo-inulinase activity was stable in range of pH of 7–8 and temperature of 30–40oC.The use of constitutiveGAPpromotermade the production of the recombinant endo-inulinase more straightforward.

มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์. สำนักหอสมุด

Address: กรุงเทพมหานคร

Email: tdckulib@ku.ac.th

Name: สาโรจน์ ศิริศันสนียกุล

Role: อาจารย์ที่ปรึกษาวิทยานิพนธ์หลัก

Name: พิลาณี ไวถนอมสัตย์

Role: อาจารย์ที่ปรึกษาวิทยานิพนธ์ร่วม

Created: 2560

Modified: 2566-04-19

Issued: 2566-04-19

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

URL: https://kasetsart.idm.oclc.org/login?url=https://www.lib.ku.ac.th/KUthesis/2560/molnapat-son-all.pdf

TP248.65.E59.ม171

tha

DegreeName: ปรัชญาดุษฎีบัณฑิต

Level: ปริญญาเอก

Descipline: เทคโนโลยีชีวภาพ

Grantor: มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์

©copyrights มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	molnapat-son-all.pdf	4.04 MB

ใช้เวลา

0.020477 วินาที