Development and evaluation of rifampicin-resistant tuberculosis diagnostic assay using high-resolution melting curve analysis combined with fluorophore probes

การพัฒนาและประเมินวิธีตรวจวินิจฉัยวัณโรคดื้อยาไรแฟมพิซินโดยการวิเคราะห์ไฮเรโซลูชันเมลติงเคิร์ฟร่วมกับฟลูออโรฟอร์โพรบ

Name: Yee Mon Thant

ThaSH: Multidrug-resistant tuberculosis

ThaSH: Tuberculosis

Abstract: Rifampicin-resistant tuberculosis (RR-TB) has become a global major public health threat. This study aims to develop a new assay, RIF-RDp, to enhance the detection of RR-TB based on combined fluorescence-labelled locked nucleic acid (LNA) probes with high-resolution melting curve analysis (HRM). Two new LNA probes were designed to target the common class-III and IV mutations of rpoB, H526D, and D516V. LNA probes showed 100% specificity in detection of mutant targets among characterized and blinded Mycobacterium tuberculosis (Mtb) isolates. The performance of RIF-RDp was evaluated using 110 blinded clinical Mtb isolates in northern Thailand against drug- susceptibility testing (DST), DNA sequencing, and a commercial real time PCR test kit. This assay showed sensitivity and specificity of 94.55% and 98.18% compared to DST, and 96.36% and 100% compared DNA sequencing method. The efficacy of RIF-RDp was comparable to the commercial kit and DNA sequencing method. The Cohen’s Kappa statistic showed almost perfect agreement between RIF-RDp and the commercial kit (κ = 0.95, 95%CI 0.89-1), RIF-RDp and DNA sequencing (κ = 0.96, 95%CI 0.92-1). Furthermore, this is the first report of the rare mutation profiles, S531W and a triple codon deletion (510-512) in northern Thailand. According to its high accuracy, the RIF-RDp assay may render an easy-to-use, low-cost, and promising diagnostics of RR-TB in the future.

Abstract: วัณโรคดื้อยาไรแฟมพิซิน (rifampicin-resistant tuberculosis: RR-TB) กลายเป็นภัยคุกคามทางสาธารณสุขที่สำคัญทั่วโลก การศึกษาครั้งนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อพัฒนาชุดตรวจใหม่ เรียกว่า“RIF-RDp” เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการตรวจหาวัณโรคดื้อยาไรแฟมพิซิน โดยอาศัยหลักการของ ล็อคนิวคลีโอไทด์โพรบ (locked nucleotide probe: LNA probe) ที่ติดฉลากด้วยสีฟลูออเรสเซนต์ร่วมกับการวิเคราะห์ด้วยไฮเรโซลูชันเมลติงเคิร์ฟ (high-resolution melting curve analysis: HRM) การศึกษานี้ได้ออกแบบ LNA probes ขึ้นใหม่สองเส้นเพื่อตรวจจับการกลายพันธุ์ที่มีความแตกต่างของนิวคลีโอไทด์เพียงตำแหน่งเดียว (single nucleotide polymorphism: SNP) รูปแบบ III (Class-III SNP) และ IV (Class-IV SNP) ที่พบบ่อยในยีน rpoB ได้แก่ H526D และ D516V จากผลการทดลองพบว่า LNA probes มีความจำเพาะ 100% ในการตรวจหาเป้าหมายที่มีการกลายพันธุ์เมื่อทดสอบกับเชื้อ Mycobacterium tuberculosis (Mtb) ทั้งชนิดที่ทราบและไม่ทราบลักษณะเฉพาะ เมื่อทำการประเมินวิธีตรวจ RIF-RDp โดยใช้ตัวอย่าง DNA ที่สกัดจากเชื้อ Mtb ที่แยกได้จากผู้ป่วยวัณโรคในเขตภาคเหนือตอนบนของประเทศไทยจำนวน 110 ตัวอย่าง โดยทำการเปรียบกับผลการทดสอบความไวต่อยาด้วยวิธีมาตรฐาน (drug-susceptibility testing: DST) การหาลำดับเบสของดีเอ็นเอ (DNA sequencing) และชุดตรวจแบบเรียลไทม์พีซีอาร์เชิงพาณิชย์ พบว่าให้ค่าความไว และความจำเพาะเท่ากับ 94.55% และ 98.18% เมื่อเทียบกับวิธี DST และเท่ากับ 96.36% และ 100% เมื่อเทียบกับวิธี DNA sequencing โดยพบว่าวิธี RIF-RDp มีประสิทธิภาพใกล้เคียงกับชุดตรวจสำเร็จรูปเชิงพาณิชย์ การวิเคราะห์โดยใช้สถิติ Cohen’s Kappa พบว่าวิธีตรวจ RIF-RDp ให้ค่าความสอดคล้องอยู่ในระดับสูงสุด (almost perfect agreement) กับชุดตรวจสำเร็จรูปเชิงพาณิชย์ (κ = 0.95, 95%CI 0.89-1) และDNA sequencing (κ = 0.96, 95%CI 0.92-1) นอกจากนี้ถือเป็นรายงานครั้งแรกของการตรวจพบการกลายพันธุ์ที่พบได้น้อยมาก ได้แก่ S531W และ Triple codon deletion ของ codons 510-512 ในภาคเหนือของประเทศไทย เนื่องจากวิธีตรวจ RIF-RDp ให้ค่าความแม่นยำสูง จึงอาจนำไปสู่การตรวจวินิจฉัยวัณโรคดื้อยาไรแฟมพิซินที่ง่ายต่อการใช้งานมีราคาต้นทุนต่อการทดสอบต่ำ และน่าเชื่อถือในอนาคต

Chiang Mai University. Library

Address: CHIANG MAI

Email: cmulibref@cmu.ac.th

Name: Angkana Chaiprasert

Role: Chairman

Name: Usanee Wattananandkul

Role: Member

Name: Chayada Sitthidet Tharinjaroen

Role: Member

Name: Ponrut Phunpae

Role: Member

Name: Bordin Butr-Indr

Role: Member

Created: 2022

Modified: 2022-11-07

Issued: 2022-11-07

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

eng

DegreeName: Science

Level: Master's Degree

Descipline: Medical Technology

Grantor: Chiang Mai University

©copyrights Chiang Mai University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	631135805.pdf	1.83 MB	1	2022-12-23 12:55:14

ใช้เวลา

0.022419 วินาที