Cryopreservation of Paphiopedilum bellatulum (Rchb.f.) Stein and P. callosum (Rchb.f.) Stein Seeds and Protocorms

การเก็บรักษาเมล็ดและโปรโตคอร์มกล้วยไม้รองเท้านารีฝาหอยและรองเท้านารีคางกบในภาวะเย็นยวดยิ่ง

Name: Supaporn Rodpradit

ThaSH: Orchids

ThaSH: Biodiversity

ThaSH: Species diversity

Abstract: Paphiopedilum Pfitzer is an attractive terrestrial lady’s slipper orchid being threatened with extinction due to over-collection and loss of habitats. Consequently, exsitu conservation methodology and strategy for this orchidare urgently needed. Two different Paphiopedilum species native to Thailand, namely Paphiopedilum bellatulum (Rchb.f.) Stein and P. callosum (Rchb.f.) Stein, were representatives of relevant subgenus. These two Paphiopedilum are characterized by different growth habits and thrive in different habitat types. Possible applications of cryopreservation as long-term ex-situ conservation strategy were explored. Three main elements were explored in this study. First, capsules and seeds were investigated in light of morphological maturity and behavior of tolerance on dehydration. Second, various techniques for cryopreservation of seeds, i.e. desiccation, vitrification and modification with aluminum foil wrap, were tested. Third, protocorms induced from cultured seeds were subjected to cryo-plate and alginate encapsulation-based methods, which involved the process of dehydration by desiccation and vitrification. For the capsules harvested at one month intervals from 5 to 9 MAP, results indicated that dimension of P. bellatulum and P. callosum capsules at 5 to 8 MAP showed no significant difference on average length and width, but the weight significantly decreased. Likewise, dimensions of P. bellatulum and P. callosum seeds at 5 to 8 MAP showed no significant differenceon average length and width, while seed moisture content (MC) continuously decreased. Seeds harvested at prolonged timing inclined to have more total seed germination percentage. P. bellatulum 9 MAPs seeds showed the highest seeds germination at 37.08% while P. callosum 8 MAPs seeds showed the highest seed germination at 32.69%. For seed cryopreservation by desiccation technique, which was investigated against increased time of desiccation under air flow of a laminar air-flow cabinet at 0-7 hour intervals, seed MC decreased to ca. 4%. After thawing from liquid nitrogen (LN), P. bellatulum 9 MAPs seeds showed the highest germination rate at 30.58% after being desiccated for 4 hours, whereas P. callosum at 8 MAPs seeds showed the highest germination rate at 33.40% after being desiccated for 4 hours. An application of modification with aluminum foil wrap technique did not show different results. For vitrification technique, in seeds, which were pretreated with LS at 25 °C for 15 min and then exposed to PVS2, it showed that P. bellatulum 9 MAPs seeds exposed to PVS2 for 60 minutes yieled the highest germination rate at 30.96% and P. callosum 8 MAPs seeds gave the highest germination rate at 44.03%. Cryopreservation of protocorms of P.bellatulum and P. callosum by encapsulation-dehydration, encapsulation-vitrification, D-cryo-plate, and V-cryo-plate technique did not present any regrowth after having been stored in LN for 1 day and recultured on ¼ MS medium for 1 month. Cryopreservation of Paphiopedilum by the application of fully mature seeds with split capsule directly immerse into LN is suitable becauseit is the most simplified, pragmatic and efficient in cost and time, especially for ex-situ long-term storage. This method can be further applied to ensure their continuous existence by preserving genetic diversity and should be an integral part in conservation strategies.

Abstract: กล้วยไม้สกุลรองเท้านารี เป็นกล้วยไม้ที่มีความสวยงามน่าดึงดูดใจ จึงถูกคุกคามเสี่ยงต่อการ สูญพันธุ์ เนื่องจากมีการเก็บออกจากธรรมชาติเป็นจำนวนมากและการสูญเสียแหล่งที่อยู่อาศัยที่ เหมาะสม ดังนั้นการนำกล้วยไม้รองเท้านารีมาอนุรักษ์นอกถิ่นกำเนิดจึงเป็นสิ่งจำเป็นเร่งด่วน กล้วยไม้รองเท้านารี 2 ชนิด ได้แก่กล้วยไม้รองเท้านารีฝาหอยและกล้วยไม้รองเท้านารีคางกบ เป็น ตัวแทนของกล้วยไม้ต่างสกุลย่อยและถิ่นอาศัยที่แตกต่างกันถูกนำมาใช้ในการศึกษาความเป็นไปได้ ในการเก็บรักษาเชื้อพันธุกรรมในระยะยาวในที่อุณหภูมิตํ่ากว่าจุดเยือกแข็งโดยการศึกษาวิจัยในครั้งนี้ ได้แบ่งการศึกษาเป็นสามส่วนหลักดังนี้ ส่วนที่หนึ่งศึกษาลักษณะทางสัณฐานวิทยาความสุกแก่ของ ฝักและเมล็ด และความทนทานต่อการลดความชื้นของเมล็ด ส่วนที่สองศึกษาการเก็บรักษาเมล็ดใน ไนโตรเจนเหลว ด้วยเทคนิคที่แตกต่างกันได้แก่ เทคนิค vitrification การผึ่งให้แห้ง และการผึ่งให้แห้ง ก่อนห่อเมล็ดด้วยอลูมิเนียมฟอยล์ และส่วนที่สามศึกษาการเก็บรักษาโปรโตคอร์มที่เกิดจากการเพาะ เมล็ด ด้วย 2 วิธีหลักคือ encapsulation และ cryo-plate ผลการวิจัยแสดงให้เห็นว่าฝักกล้วยไม้รองเท้าฝาหอยและรองเท้านารีคางกบ ที่เก็บในทุก ช่วงเวลา 1 เดือน ตั้งแต่ 5–9 เดือน หลังจากการผสมเกสร ขนาดความกว้างและความยาวของฝักไม่มี ความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญแต่น้ำหนักมีการลดลงตามลำดับ เช่นเดียวกับขนาดของเมล็ดและ เอมบริโอไม่มีการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญ แต่ความชื้นในเมล็ดลดลงอย่างต่อเนี่อง ระดับ ความสุกแก่ของเมล็ดมีผลต่ออัตราการงอกอย่างมีนัยสำคัญ โดยเมล็ดที่มีอายุมากจะมีอัตราการงอก ของเมล็ดที่สูงขึ้น โดยเมล็ดกล้วยไม้รองเท้านารีฝาหอยอายุ 9 เดือน มีอัตราการงอกของเมล็ดสูงสุด ร้อยละ 37.08 ในขณะที่กล้วยไม้รองเท้านารีคางกบอายุ 8 เดือนพบอัตราการงอกของเมล็ดสูงสุดร้อย ละ 32.69 สำหรับผลการเก็บรักษาเมล็ดในไนโตรเจนเหลว การผึ่งเมล็ดให้แห้งโดยการเป่าลมในตู้ larminar air flowในช่วงเวลา 0-7 ชัว่ โมง ความชื้นในเมล็ดลดลงอย่างต่อเน่ืองจนถึงประมาณร้อยละ 4 โดยภายหลังจากการทดสอบแช่ในไนโตรเจนเหลว เมล็ดกล้วยไม้รองเท้านารีฝาหอยอายุ 9 เดือน ที่ผึ่ง ลมเป็นเวลา 4 ชัว่ โมง มีอัตราการงอกสูงสุดร้อยละ 30.58 สำหรับเมล็ดกล้วยไม้รองเท้านารีคางกบอายุ 9 เดือน ผึ่งลมเป็นเวลา 4 ชั่วโมงมีอัตราการงอกสูงสุดร้อยละ 33.40 สำหรับวิธีการห่อเมล็ดด้วย อลูมิเนียมฟอยล์หลังจากการผึ่งลมให้ผลไม่แตกต่างกัน สำหรับเทคนิค vitrification การปรับสภาพ เมล็ดด้วยการแช่ในสารละลาย loading solution (LS) ที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 15 นาที ตามด้วยการแช่ใน PVS2 เป็นเวลา 60 นาที เมล็ดกล้วยไม้รองเท้านารีฝาหอยอายุ 9 เดือนมีอัตราการ งอกสูงสุดที่ร้อยละ 30.96 และกล้วยไม้รองเท้านารีคางกบอายุ 8 เดือนมีอัตราการงอกสูงสุดที่ร้อยละ 44.03 สำหรับการเก็บรักษาโปรโตคอร์มโปรโตคอร์มของกล้วยไม้รองเท้านารีฝาหอยและรองเท้านารี คางกบ ด้วยวิธี encapsulation-dehydration, encapsulation-vitrification, D-cryo-plate, and V-cryoplate technique พบว่าภายหลังจากการ preculture และลดความชื้น ก่อนนำไปแช่ในไนโตรเจนเหลว เป็นเวลา 1 วัน และนำไปเพาะเลี้ยงในอาหารสูตร ¼ MS เป็นเวลา 1 เดือน ไม่พบอัตราการรอดชีวิต การเก็บรักษาเมล็ดกล้วยไม้รองเท้านารีในที่อุณหภูมิตํ่ากว่าจุดเยือกแข็ง โดยใช้เมล็ดที่สุกแก่ เต็มที่ในระยะฝักแตก โดยการแช่เมล็ดลงในไนโตรเจนเหลวโดยตรง เป็นวิธีที่เหมาะสมเนื่องจากง่าย และวิธีนี้จะช่วยลดเวลาและค่าใช้จ่ายในการอนุรักษ์นอกถิ่นอาศัย โดยวิธีการนี้จะเป็นการรับประกัน การคงอยู่โดยการเก็บรักษาเชื้อพันธุกรรมไว้ โดยจะเป็ นส่วนหนึ่งที่มีบทบาทสำคัญในการบรรลุ เป้าหมายการอนุรักษ์พืช

Chiang Mai University. Library

Address: CHIANG MAI

Email: cmulibref@cmu.ac.th

Name: Santi Watthana

Role: Chairman

Name: Prasit Wangpakapattanawong

Role: Member

Name: Pheravut Wongsawad

Role: Member

Name: Kanchit Thammasiri

Role: Member

Name: Anupan Kongbangkerd

Role: กรรมการ

Created: 2020

Modified: 2022-10-27

Issued: 2022-10-27

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Biodiversity and Ethnobiology

Grantor: Chiang Mai University

©copyrights Chiang Mai University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	580551016.pdf	1.84 MB	1	2025-10-07 13:25:07

ใช้เวลา

0.025184 วินาที