Immobilization of horseradish peroxidase on chitosan beads for phenol removal

การตรึงฮอร์สเรดิชเปอร์ออกซิเดสบนบีดไคโตซานเพื่อการขจัดฟีนอล

Name: Thaninthorn Netitheerasuk

ThaSH: Phenol

ThaSH: Chitosan

ThaSH: Immobilized enzymes

Abstract: This research aims to search for the appropriate chitosan for horseradish peroxidase (HRP) immobilization for phenol removal. The supports used were chitosan membrane, spray dried chitosan, 2%, 3%, 5% (w/v) of dry chitosan beads and 3% (w/v) of wet chitosan beads. Scanning electron microscopy (SEM) showed that 3% (w/v) of both chitosan beads were appropriate to be used for the immobilization of enzymes by covalent linkage using glutaraldehyde. The immobilization parameters such as concentration of coupling agent and coupling time were optimized. It was determined that the optimum conditions for enzyme immobilization were to activate dry support with 1.5% (v/v) of glutaraldehyde for 8 hours and 1.0% (v/v) of glutaraldehyde for 10 hours for wet support. The activated support was then incubated with the enzyme solution for 2 hours at room temperature, using 2.5 units for both supports. After immobilization, the optimum pH and temperature of immobilized HRP was found to be the same as that of the free enzyme (5.5 and at 25oC). The pH stability of free and enzyme immobilized on both dry and wet chitosan beads was 5.5, whereas the thermal stability of immobilized HRP on dry beads was slightly higher than that of the immobilized HRP on wet beads. The performance of enzymes immobilized on both supports was compared. In the first set of the experiment, glutaraldehyde (1.5%, v/v, 8 hours) and HRP solution (10 µg) were allowed to react with the beads sequentially with and without agitation. In another set of experiments, glutaraldehyde and HRP solution were mixed prior to the addition to the supports with and without agitation. It was found that wet chitosan beads incubated with 1.5% (v/v) glutaraldehyde and HRP consecutively gave best immobilized activity at 2 hours incubation. Phenol removal by HRP immobilized on wet chitosan beads was highest at room temperature and at pH 10.0 Reusability of the immobilized enzyme for the removal of phenol after 5 repeated use still retained the ability to remove phenol up to 36%. The HRP immobilized on wet beads showed higher stability than the native enzyme when stored at both 25 and 4°C for 1 month.

Abstract: งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อหาตัวค้ำไคโตซานที่เหมาะสมเพื่อใช้ตรึงฮอร์สเรดิชเปอร์ออกซิเดส (HRP) เพื่อใช้ขจัดฟีนอล ตัวค้ำที่ถูกนำมาใช้คือ เมมเบรนไคโตซาน สเปรย์ดรายด์ไคโตซาน บีดไคโตซานชนิดแห้ง ที่มีความเข้มข้น 2%, 3%, 5% (w/v) และ บีดไคโตซานชนิดเปียก ที่ความเข้มข้น 3% (w/v) เมื่อนำไปศึกษาด้วย Scanning electron microscopy (SEM) พบว่าบีดไคโตซานเข้มข้น 3% (w/v) ทั้งสองชนิดมีความเหมาะสมที่จะนำไปศึกษาการตรึงเอนไซม์โดยใช้ กลูตารัลดีไฮด์เป็นตัวเชื่อม ทำการหาภาวะที่เหมาะสมของตัวแปรต่างๆที่มีผลต่อการตรึงเอนไซม์ เช่น ความเข้มข้นของตัวกระตุ้นและเวลาในการบ่ม พบว่าต้องกระตุ้นบีดไคโตซานชนิดแห้งด้วยสารละลายกลูตารัลดีไฮด์เข้มข้น 1.5% (v/v) ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 8 ชั่วโมง ในขณะที่บีดไคโตซานชนิดเปียกจะถูกกระตุ้นด้วยกลูตารัลดีไฮด์เข้มข้น 1.0% (v/v) ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 10 ชั่วโมง ตัวค้ำทั้งสองชนิดใช้เอนไซม์ในการตรึง 2.5 ยูนิต และใช้เวลาในการบ่มกับเอนไซม์ 2 ชั่วโมง หลังจากทำการตรึงแล้วพบว่าเอนไซม์ตรึงมีความสามารถในการทำปฏิกิริยาดีที่สุดที่ pH 5.5 และที่อุณหภูมิ 25ºซ ซึ่งเหมือนกับเอนไซม์อิสระ เอนไซม์อิสระและเอนไซม์ตรึงมีความเสถียรที่ pH 5.5 ทำการเปรียบเทียบประสิทธิภาพของเอนไซม์ตรึงบนตัวค้ำทั้งสองในชุดปฏิกิริยาแรกจะบ่มกลูตารัลดีไฮด์ (1.5%, v/v) กับตัวค้ำ 8 ชั่วโมง จากนั้นจึงบ่มกับสารละลาย HRP (10 ไมโครกรัม) ในสภาวะกวนและไม่กวน ส่วนในอีกชุดของการทดลองจะทำการบ่มกลูตารัลดีไฮด์กับสารละลาย HRP ก่อนเติมลงไปบนตัวค้ำทั้งสอง พบว่าการบ่มกลูตารัลดีไฮด์ (1.5%, v/v) กับตัวค้ำ 8 ชั่วโมง ก่อนบ่มเอนไซม์กับตัวค้ำนาน 2 ชั่วโมง มีประสิทธิภาพการตรึงดีที่สุด จากนั้นนำการตรึงเอนไซม์รูปแบบนี้มาใช้ในการขจัดฟีนอล พบว่าเอนไซม์ตรึงสามารถขจัดฟีนอลสูงสุดที่อุณหภูมิ 25oซ, pH 10 และเมื่อนำเอนไซม์มาใช้ซ้ำพบว่าเอนไซม์ตรึงสามารถขจัดฟีนอลได้ถึง 36% หลังการใช้งาน 5 ครั้ง เมื่อศึกษาความเสถียรของการเก็บรักษาของเอนไซม์ตรึงและเอนไซม์อิสระนาน 1 เดือน พบว่าเอนไซม์ตรึงบนบีดชนิดเปียกมีความเสถียรต่อการเก็บรักษาทั้งที่อุณหภูมิ 25 และ 4oซ สูงกว่าเอนไซม์อิสระ

Chulalongkorn University. Office of Academic Resources

Address: BANGKOK

Email: cuir@car.chula.ac.th

Name: Manchumas Prousoontorn

Role: advisor

Created: 2013

Modified: 2020-07-01

Issued: 2020-07-01

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

URL: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/51983

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Biotechnology

Grantor: Chulalongkorn University

©copyrights Chulalongkorn University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	thaninthorn_ne.pdf	2.35 MB

ใช้เวลา

0.052712 วินาที