Epidemiology, development of molecular diagnostic of human enterovirus and recombination and evolutionary dynamics of human coxsackievirus A6

ระบาดวิทยา การพัฒนาการตรวจวินิจฉัยระดับโมเลกุลของเชื้อฮิวแมนเอนเทอโรไวรัส และการเกิดรีคอมบิเนชันและวิวัฒนาการของเชื้อฮิวแมนคอกแซกกีไวรัส เอ 6

Name: Jiratchaya Peunpa

Abstract: Hand, foot, and mouth disease (HFMD) is a common infectious disease caused by several genotypes of human enterovirus species A and represent a significant global public health concern. Enterovirus 71 (EV71) infections cause a deadly neurological disease for which no specific anti-viral drugs or vaccines has received regulatory approval. Published reports have described a dramatically increased incidence of coxsackievirus A6 (CV-A6) infections associated with HFMD since their occurrence in 2008 in Finland. The aim of this study was to evaluate the burden of human enteroviruses associated to HFMD and herpangina in patients and establish epidemiological profiles of these viruses in Thailand in 2012. Detection and genotype determination of enteroviruses were accomplished by reverse transcription-polymerase chain reaction and sequencing of the VP1 region. Enterovirus-positive samples were differentiated into 17 genotypes (CV-A 4, A5, A6, A8, A9, A10, A12, A16, A21, B1, B2, B4, B5, echovirus 7, 16, 25 and EV71). The result showed CV-A6 (33.5%), followed by CV-A 16 (9.4%) and EV71 (8.8%) as the most frequent genotypes in HFMD, CV-A 8 (19.3%) in herpangina and CAV6 (1.5%) in influenza like illness. Enterovirus infections were most prevalent during July with 34.4% in HFMD, 39.8% in herpangina and 1.6% in ILI. The higher enterovirus infection associated with HFMD and herpangina occurred in infants over one year-old. This represents the first report describing the circulation of multiple enteroviruses in Thailand. Furthermore, multiplex real-time PCR using TaqMan probes for broad detection of EVs and differentiation of EV71, CV-A6 and CV-A16 were developed and validated. The multiplex real-time PCR system which was run in two separate tubes was capable of screening and specific detection of the three selected enteroviruses, without cross-reactions with the other examined RNA viruses. The detection limit of the assays was 10 copies/µl for EV71, CV-A6, CV-A16 and panenterovirus. The overall diagnostic sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV) and negative predictive value (NPV) of the multiplex rRT-PCR assay were greater than those of conventional RT-PCRs. The multiplex rRT-PCR assays provide the highly sensitive detection and rapid simultaneous typing of EV71, CV-A6 and CV-A16 thus rendering it feasible and attractive for large scale surveillance of EVs associated with HFMD outbreaks. Moreover, this study also investigated the relationship between these disease outbreaks with the evolutionary dynamics of CV-A6 and the appearance of novel recombinant forms (RFs) of the virus. Based on the analysis of the VP1 gene, the substitution rates of CV-A6 was estimated at 8.1 × 10-3 substitutions/site/year. There was an increasing likelihood between CV-A6 genome recombination and VP1 sequence divergence, with an estimated half-life of the RFs of 3.1 years. Bayesian phylogenetic analysis of the data showed that recently occurring recombination groups (RF-E, -F, -H, -J and -K) shared a common ancestor (RF-A). Recombination breakpoints were frequently observed between the 2A-2C gene and the 5´ untranslated region. This study revealed the potential for new CV-A6 variants to emerge and potentially modify disease outcomes of this major etiologic agent for HFMD affecting children worldwide.

Abstract: โรคมือ เท้า ปาก มีสาเหตุเกิดจากเชื้อไวรัสในกลุ่มเอนเทอโรไวรัส สปีชีย์เอ ซึ่งมีอยู่มากกว่า 20 สายพันธุ์ ที่เป็นปัญหาใหญ่ทางเศรษฐกิจ สังคม ในประเทศไทยและทั่วโลก หนึ่งในไวรัสที่มีบทบาทสำคัญต่อการเกิดโรคคือ เชื้อเอนเทอโรไวรัส 71 สามารถก่อให้เกิดโรคแทรกซ้อนทางระบบประสาทและสมองที่รุนแรงจนเป็นเหตุให้เสียชีวิตได้ ปัจจุบันยังไม่มีวัคซีนและยารักษาที่มีประสิทธิภาพ งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาระบาดวิทยาและการเปลี่ยนแปลงสายพันธุ์ไวรัส มือ เท้า ปาก ที่เกิดการระบาดในประเทศไทยในปี พ.ศ. 2555 เปรียบเทียบกับการระบาดในอดีตที่ผ่านมา โดยทำการตรวจวิเคราะห์ตัวอย่างจากกลุ่มผู้ป่วยโรคมือ เท้า ปาก, โรคเฮอร์แปงไจนา และผู้ป่วยติดเชื้อในระบบทางเดินหายใจ ทำการตรวจหาเชื้อฮิวแมนเอนเทอโรไวรัส โดยอาศัยวิธีการ semi-nested RT-PCR ผลการวิจัยพบว่าสามารถตรวจพบเชื้อฮิวแมนเอนเทอโรไวรัสทั้งสิ้น 17 สายพันธุ์ (คอกซากีไวรัส เอ 4, เอ 5, เอ 6, เอ 8, เอ 9, เอ 10, เอ 12, เอ 16, เอ 21, บี 1, บี 2, บี 4, บี 5, เอคโคไวรัส 7, 16, 25 และเอนเทอโรไวรัส 71) โดยเชื้อคอกซากีไวรัส เอ 6 เป็นสายพันธุ์ที่พบมากที่สุดในกลุ่มผู้ป่วยโรคมือ เท้า ปากและผู้ป่วยติดเชื้อในระบบทางเดินหายใจ คิดเป็นร้อยละ 33.5 และร้อยละ 1.5 ตามลำดับ เชื้อคอกซากีไวรัส เอ 8 พบมากที่สุดในกลุ่มผู้ป่วยโรคเฮอร์แปงไจนา คิดเป็นร้อยละ 19.3 ลักษณะการระบาดของเชื้อเอนเทอโรไวรัสในช่วงที่มีศึกษานี้พบว่ามีการกระจายตัวของเชื้อเอนเทอโรไวรัสตลอดทั้งปี และพบมากที่สุดในเดือนกรกฏาคม ในกลุ่มผู้ป่วยทั้งสามกลุ่มมีอัตราการติดเชื้อเอนเทอโรไวรัสมากที่สุดในเด็กอายุมากกว่าหรือเท่ากับ 1 ปี จากนั้นได้ทำการพัฒนาการตรวจวินิจฉัยระดับโมเลกุลของเชื้อฮิวแมนเอนเทอโรไวรัสโดยเฉพาะสายพันธุ์ที่พบในประเทศไทย ด้วยเทคนิค multiplex real-time RT-PCR ผลการศึกษาพบว่า ในการทดสอบความจำเพาะและความไวของเทคนิค multiplex real-time RT-PCR พบว่า ไม่เกิด cross reactivity ต่อเชื้อไวรัสชนิดอื่นที่ก่อโรคทั้งในระบบทางเดินอาหารและทางเดินหายใจ แสดงให้เห็นว่าไพรเมอร์และโพรบในงานวิจัยนี้มีความจำเพาะสูงต่อเชื้อเป้าหมาย และผลความไวของเทคนิคต่อเชื้อเป้าหมาย พบว่า สามารถตรวจจับได้ในปริมาณ 10 copies/µl เมื่อเปรียบเทียบประสิทธิภาพของเทคนิค multiplex real-time RT-PCR กับ conventional RT-PCR ในการตรวจหาเชื้อเอนเทอโรไวรัสจำนวน 1,313 ตัวอย่าง จากกลุ่มผู้ป่วยโรคมือ เท้า ปาก, โรคเฮอร์แปงไจนา ผลการวิเคราะห์พบว่าเทคนิค multiplex real-time RT-PCR มีความไวและความจำเพาะในการตรวจจับเชื้อฮิวแมนเอนเทอโรไวรัสมากกว่าเทคนิค conventional RT-PCR ดังนั้น เทคนิค multiplex real-time RT-PCR ในงานวิจัยนี้มีประโยชน์สูงทั้งในด้านความเร็วในการตรวจวินิจฉัยของโรค มีความจำเพาะและมีความไวต่อเชื้อฮิวแมนเอนเทอโรไวรัส ซึ่งเป็นวิธีที่เหมาะสมที่สุดเพื่อที่จะนำมาใช้ในการควบคุมและป้องกันการระบาดของโรคมือเท้าปาก นอกจากนี้ ในช่วงระยะเวลาใกล้เคียงกันหลายๆประเทศก็ได้มีการรายงานอุบัติการณ์การเพิ่มขึ้นของการติดเชื้อคอกซากีไวรัส เอ 6 ที่เกี่ยวข้องกับการเกิดโรคมือ เท้า ปาก ซึ่งเริ่มมีรายงานการระบาดใหญ่ครั้งแรกที่ประเทศฟินแลนด์ในปี พ.ศ. 2551 พบว่าการติดเชื้อไวรัสสายพันธุ์นี้ มีแนวโน้มที่ผู้ป่วยจะแสดงอาการรุนแรงมากกว่าการติดเชื้อฮิวแมนเอนเทอโรไวรัสสายพันธุ์อื่นๆ งานวิจัยนี้ทำการศึกษาวิวัฒนาการและการเกิดรีคอมบิเนชันของเชื้อคอกซากีไวรัส เอ 6 โดยเก็บตัวอย่างจาก 5 ประเทศ ได้แก่ ไทย สวีเดน เดนมาร์ค สเปน และ เยอรมัน ผลการวิจัยพบว่า อัตราของการเปลี่ยนแปลงทางวิวัฒนาการของเชื้อไวรัสนี้เท่ากับ 8.1 × 10-3 จำนวนนิวคลีโอไทด์ที่ถูกแทนที่ต่อหนึ่งตำแหน่งต่อปี ในการเกิดรีคอมบิเนชันของเชื้อไวรัสนี้ที่ช่วงระยะเวลาต่างๆ พบว่าเกี่ยวข้องกับการแทนที่ของยีนที่ไม่ใช่ยีนโครงสร้าง เมื่อคำนวณระยะเวลาที่ครึ่งหนึ่งของเชื้อไวรัสนี้จะเกิดรีคอมบิเนชัน มีค่าเท่ากับ 3.1 ปี สรุปได้ว่าการเกิดความหลากหลายทางพันธุกรรมของเชื้อไวรัสนี้ใช้เวลาที่สั้นกว่าเชื้อเอนเทอโรไวรัส 71 นอกจากนี้ จุดที่เกิดการรวมของจีโนไทป์ (recombination breakpoint) ของเชื้อไวรัสนี้พบว่าเกิดขึ้นที่บริเวณยีน 2A-2C และ 5´ untranslated region กล่าวโดยสรุปงานวิจัยนี้แสดงให้เห็นถึงการเกิดสายพันธุ์ใหม่ของเชื้อคอกซากีไวรัส เอ 6 และทำให้เกิดการระบาดของโรคมือ เท้า ปากทั่วโลก

Chulalongkorn University. Office of Academic Resources

Address: BANGKOK

Email: cuir@car.chula.ac.th

Name: Yong Poovorawan

Role: advisor

Created: 2015

Modified: 2019-08-30

Issued: 2019-08-30

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

URL: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/56402

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Medical Science

Grantor: Chulalongkorn University

©copyrights Chulalongkorn University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	5574903830[1].pdf	5.61 MB	4	2022-03-02 21:10:40

ใช้เวลา

0.024759 วินาที