การทำเอนไซม์ไซโคลเดกซ์ทรินไกลโคซิลทรานสเฟอเรสให้บริสุทธิ์ โดยวิธีโครมาโทกราฟีแบบสัมพรรคภาพอิมมูโน

Purification of cyclodextrin glycosyltransferase by immunoaffinity chromatography

Name: พรชัย แซ่กิม

ThaSH: โครมาโทกราฟี

Abstract: ศึกษาการทำแอนติบอดีต่อเอนไซม์ไซโคลเดกซ์ทรินไกลโคซิลทรานสเฟอเรสจากซีรั่มกระต่ายให้บริสุทธิ์ โดยใช้วิธีการตกตะกอนด้วยแอมโมเนียมซัลเฟตที่ความเข้มข้นอิ่มตัว 45% และทำโครมาโทกราฟีแบบแลกเปลี่ยนไอออนด้วย DEAE-cellulose พบว่าที่ pH 6.5 แอนติบอดีต่อเอนไซม์ CGTase ไม่ยึดติดกับ DEAE-cellulose resin แอนติบอดีที่เตรียมได้มีความบริสุทธิ์จากการตรวจสอบโดยโพลีอะคริลาไมด์เจลอิเลคโทรโฟรีซิสแบบเอสดีเอส และมีความจำเพาะต่อเอนไซม์ CGTase โดยมีค่าไดเตอร์เท่ากับ 1:2 8 จากการวิเคราะห์ด้วยวิธี Ouchterlony immunodiffusion ได้ทดลองตรึงแอนติบอดีต่อเอนไซม์ CGTase เข้ากับตัวค้ำ CNBr-activated Sepharose 4 B เพื่อเตรียมแอนติบอดีคอลัมน์เพื่อใช้แยกเอนไซม์ CGTase ให้บริสุทธิ์ พบว่าตรึงแอนติบอดีเข้ากับตัวค้ำได้ 98% คิดเป็นปริมาณแอนติบอดี 4.9 มิลลิกรัมต่อตัวค้ำ 1 มิลลิลิตร สภาวะที่เหมาะสมในการแยกเอนไซม์ CGTase ให้ออกจากแอนติบอดีคอลัมน์คือ การใช้สารละลายแอมโมเนียมไฮดรอกไซด์ 50 mM, pH 10.5 ที่มีโซเดียมไธโอไซยาเนต 3.5 Mเป็นสารชะ ด้วยอัตราการชะ 0.1 มิลลิลิตรต่อนาทีที่อุณหภูมิห้อง เอนไซม์ CGTase ที่เตรียมได้มีความบริสุทธิ์เพิ่มขึ้น 155 เท่า และ enzyme yield 45% เมื่อทำการแยกเอนไซม์ CGTase โดยโพลีอะคริลาไมด์เจลอิเลคโทรโฟรีซิสแบบไม่เสียสภาพ พบแถบโปรตีน 2 แถบ แต่จากการทำโพลีอะคริลาไมด์เจลอิเลคโทรโฟรรีซิสแบบเอสดีเอสจะเห็นแถบโปรตีนเพียงแถบเดียวและมีน้ำหนักโมเลกุลประมาณ 72,000 ดาลตัน

Abstract: A polyclonal antibody prepared cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) was purified from rabbit antiserum by ammonium sulfate precipitation with a 45% saturation and DEAE-cellulose ion exchange chromatography. Fractions were tested for the presence and purity of IgG by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The result demonstrated that antibody against CGTase of high purity was obtained by the described purification method and the antibody titer was determined to be 1:2 8 by ouchterlony immunodiffusion. The purified antibody was linked to CNBr-activated Sepharose 4 B and used for immunoaffinity purification of CGTase. The bound enzyme was eluted with 3.5 M sodium thiocyanate in 50 mM ammonium hydroxide, pH 10.5, at a flow rate 0.1 millilitre/minute at room temperature. The specific activity of the purfied CGTase was increased 155 folds and about 45% of the total activity was recovered. The prepared enzyme was separated into two bands after non denaturing-polycrylamide gel electrophoresis, but showed only a single band in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The molecular weight of the protein band was estimated to be 72,000 dalton.

จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. สำนักงานวิทยทรัพยากร

Address: กรุงเทพมหานคร

Email: cuir@car.chula.ac.th

Name: เปี่ยมสุข พงษ์สวัสดิ์

Role: ที่ปรึกษา

Name: ทิพาพร ลิมปเสนีย์

Role: ที่ปรึกษา

Name: สมพร กมลศิริพิชัยพร

Role: ที่ปรึกษา

Created: 2539

Modified: 2560-02-15

Issued: 2560-01-29

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9746349457

URL: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/10176

tha

DegreeName: วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต

Level: ปริญญาโท

Descipline: เทคโนโลยีทางชีวภาพ

Grantor: จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย

©copyrights จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	Pornchai_Ki_front.pdf	787.93 KB	1	2017-06-17 16:22:02
2	Pornchai_Ki_ch1.pdf	820.35 KB	1	2017-06-17 16:22:02
3	Pornchai_Ki_ch2.pdf	837.71 KB	1	2017-06-17 16:22:02
4	Pornchai_Ki_ch3.pdf	1.12 MB	1	2017-06-17 16:22:01
5	Pornchai_Ki_ch4.pdf	832.17 KB	1	2017-06-17 16:22:01
6	Pornchai_Ki_back.pdf	830.2 KB	1	2017-06-17 16:22:01

ใช้เวลา

0.02644 วินาที