แจ้งเอกสารไม่ครบถ้วน, ไม่ตรงกับชื่อเรื่อง หรือมีข้อผิดพลาดเกี่ยวกับเอกสาร ติดต่อที่นี่ ==>
หากไม่มีอีเมลผู้รับให้กรอก thailis-noc@uni.net.th
หากไม่มีอีเมลผู้รับให้กรอก thailis-noc@uni.net.th
Chakard Chalayut. Cloning expression purification and enzymological characterization of NS2BNS3 protease protein of japanese encephalitis virus. Master's Degree(Molecular Genetics and Genetic Engineering). Mahidol University. Mahidol University Library and Knowledge Center. : Mahidol University, 2009.
Cloning expression purification and enzymological characterization of NS2BNS3 protease protein of japanese encephalitis virus
การโคลนนิ่ง การแสดงออก การทำให้บริสุทธิ์ และคุณลักษณะทางเอนไซม์ของโปรตีนโปรตีเอส NS2B/NS3 ของไวรัสไข้สมองอักเสบ
Name: Chakard Chalayut
MeSH:
Flavivirus
Abstract:
Japanese Encephalitis Virus (JEV), a member of the Flaviviridae family, is a
mosquito borne neurotropic flavivirus that causes severe diseases of the central nervous
system. Currently, several vaccines are in clinical use, however, their use is restricted due to
high costs and occasional adverse effects. The development of small molecule drugs against
viral target enzymes such as the NS2B-NS3 protease therefore are urgently required. This
study therefore aimed to analyze the differences in the mechanism of cofactor activation
between dengue virus and Japanese encephalitis virus NS2B(H)-NS3(pro) by characterization
of the two-component protease by establishing a rapid, sensitive and easy to perform assay
with the fluorogenic substrates. In this study, the peptide substrates incorporated with
fluorogenic group (amc) were used and a general methodology for the cloning, expression and
purification of the Japanese encephalitis virus protease was developed. The sequence of
NS2B-NS3 from JEV was obtained by synthetic gene. The protease complex NS2B(H)-
NS3pro was obtained by SOE-PCR. Constructs were cloned and over expressed in E.coli,
purified by metal affinity chromatography and size exclusion, then the protein sample was
subjected to analysis by SDS-PAGE, Western Blotting and a fluorogenic assay with the
synthetic substrate RTKR-amc and GRR-amc. Kinetic studies revealed the kinetic parameters
(Km, kcat) and also demonstrated kinetic differences between dengue and Japanese encephalitis
virus. However, the Japanese Encephalitis virus protease is similar in pH and ionic strength to
the Dengue virus. These novel findings make for a better understanding of the NS2B(H)-
NS3(pro) of Japanese encephalitis virus to the related Flavivirus and provide a starting point
for further characterization of substrate specificity and inhibitor design for the JEV protease.
Abstract:
ไวรัสไข้สมองอักเสบ เป็นไวรัสหนึ่งในตระกูลไวรัส Flaviviridae ซึ่งเป็นไวรัสที่มียุงเป็นพาหะนำ
ทำให้ก่อโรคที่รุนแรงในระบบประสาทส่วนกลาง ในปัจจุบันมีวัคซีนที่ใช้ในการรักษาแต่ก็มีข้อจำกัดในเนื่องจาก
มีราคาสูงและมีโอกาสที่จะเกิดผลข้างเคียงได้ การพัฒนายาที่มีโมเลกุลขนาดเล็ก ที่สามารถต่อต้านไวรัสโดยมี
เป้าหมายคือโปรตีนโปรตีเอส NS2B-NS3 เป็นสิ่งที่จำเป็นอย่างเร่งด่วน ในการศึกษานี้มีวัตถุประสงค์ที่จะวิเคราะห์
ความแตกต่างของการกระตุ้นด้วยโคเฟคเตอร์ของโปรตีน NS2B(H)-NS3(pro) ระหว่างไวรัสเดงกี่และไวรัสไข้
สมองอักเสบ ด้วยการจำแนกส่วนประกอบทั้ง 2 ของโปรตีนด้วยวิธีการที่รวดเร็ว ตอบสนองไวและง่ายที่จะทำการ
วิเคราะห์ด้วยสารตั้งต้นที่เรืองแสงฟลูออเรสเซนต์ ซึ่งในการศึกษานี้ได้พัฒนาวิธีการโคลนนิ่ง การแสดงออกของ
โปรตีนและทำโปรตีนของโปรตีเอสไวรัสไข้สมองอักเสบให้บริสุทธิ์และใช้สารตั้งต้นที่เป็นเปปไทด์ที่มีสารเรือง
แสงฟลูออเรสเซนต์ (amc) ในการทดลอง ลำดับพันธุกรรม NS2B-NS3 จากไวรัสไข้สมองอักเสบได้ถูกสังเคราะห์
และเป็นต้นแบบในการสร้างลำดับพันธุกรรมของโปรตีน NS2B(H)-NS3(pro) ด้วยวิธีการ SOE-PCR ลำดับ
พันธุกรรมดังกล่าวได้ทำการโคลนนิ่งและทำการแสดงออกในแบคทีเรีย E.coli และทำให้บริสุทธิ์ด้วยวิธี metal
affinity chromatography และ size exclusion chromatography จากนั้นโปรตีนได้ทำการตรวจสอบวิเคราะห์โดย
SDS-PAGE, western blotting และทำการทดสอบวิเคราะห์ด้วยสารตั้งต้น RTKR-amc และ GRR-amc การศึกษา
ทางจลศาสตร์แสดงให้เห็นถึงค่าจลศาสตร์ของโปรตีนโปรตีเอสไวรัสไข้สมองอเสบและความแตกต่างระหว่าง
โปรตีนของไวรัสเดงกี่และไวรัสไข้สมองอักเสบ อย่างไรก็ตามโปรตีนของไวรัสไข้สมองอักเสบมีการตอบสนอง ต่อค่า
pH และ ionic strength ที่เหมือนกัน ซึ่งการค้นพบครั้งนี้ทำให้เข้าใจคุณลักษณะโปรตีน NS2B(H)-NS3(pro) ของ
ไวรัสไข้สมองอักเสบต่อไวรัสสายพันธุ์ Flavivirus ได้ดีขึ้น และเป็นจุดเริ่มต้นในการจำแนกสารตั้งต้นที่มี
ความจำเพาะและใช้ในการออกแบบสารยับยั้งต่อโปรตีเอสของไวรัสไข้สมองอักเสบได้ต่อไป
Mahidol University. Mahidol University Library and Knowledge Center
Address:
NAKHONPATHOM
Email:
liwww@mahidol.ac.th
Name: Katzenmeier Gerd
Role:
Thesis Advisors
Created:
2009
Modified:
2553-07-24
Issued:
2010-07-24
วิทยานิพนธ์/Thesis
application/pdf
CallNumber:
TH C435c 2009
eng
DegreeName: Master of Science
Level: Master's Degree
Descipline: Molecular Genetics and Genetic Engineering
Grantor: Mahidol University
©copyrights Mahidol University
RightsAccess:
ใช้เวลา
0.455065 วินาที
Chakard Chalayut
| Title | Contributor | Type |
|---|---|---|
| Cloning expression purification and enzymological characterization of NS2BNS3 protease protein of japanese encephalitis virus
มหาวิทยาลัยมหิดล Chakard Chalayut | Katzenmeier Gerd | วิทยานิพนธ์/Thesis |
Katzenmeier Gerd