Cloning expression and purification of the dengue virus NS3 helicase domain and analysis of the catalytic properties

การสร้างและการทำให้เอนไซม์ NS3 helicase จากไวรัสไข้เลือดออก ซีโรไทป์ 2 บริสุทธิ์เพื่อการศึกษาคุณสมบัติทางชีวเคมีในหลอดทดลอง

Name: Ratchanu Tongphung

MeSH: Dengue Virus

MeSH: Nucleoside-Triphosphatase

LCSH: Dengue

LCSH: NS3 helicase

Abstract: Nonstructural protein 3 (NS3) of dengue virus type 2 (DEN-2) is a multifunctional protein composed of two domains, a serine protease in the N-terminal domain (NS3pro) and RNA-stimulated nucleoside triphosphatase (NTPase)/RNA helicase at the C-terminus (NS3h). NS3 plays an important role in viral replication and represents coordinated regulation of all the catalytic activities in the full-length NS3 protein, However, it still remains unclear whether enzyme activities of NS3 are functionally interdependent or modulated by interplay of the domain elements. In this study, plasmid harboring NS3 helicase domain and the NS2B hydrophilic domain linked to the NS3 full-length gene , NS2B(H)NS3FL, were constructed by PCR and restriction enzyme digestion. The two recombinant proteins were expressed in Escherichia coli. The degraded products of protein were observed under the 79.1 kDa of NS2B(H)NS3FL at both 30º C and 37º C incubation condition. The 56.5 kDa NS3h was purified by metal chelate affinity chromatography followed by renaturation of precursors, mediated by artificial chaperone-assisted refolding which yielded the active helicase. NTPase assay based on colorimetric method with malachite reagent was performed NTPase activity of NS3 helicase in the presence of ATP showed a higher turnover and Km value than the reaction without ATP. The activity increased approximately 3-fold in the presence of polynucleotides. This indicates that NTPase activity of dengue NS3 can be stimulated by polynucleotide. For helicase function of NS3h, helicase assay was conducted using short internally quenched DNA oligonucleotides for the helicase. The assay was based on fluorescence release, in the presence and absence of polynucleotides. Significant fluorescence signaling increase was observed in the presence of polynucleotides. No unwinding activity was observed with addition of poly U. This indicates effect of polynucleotides on helicase activity. These results suggest the same or overlapping bingding site of polynucleotide and RNA duplex on NS3 protein

Abstract: โปรตีน NS3 helicase (NS3h) ของเชื้อไวรัสไข้เลือดออก ซีโรไทป์ 2 (DEN-2) ประกอบไปด้วย ส่วนที่สำคัญ 2 ส่วนคือ ส่วนที่มีคุณสมบัติของเอนไซม์ซีรีนโปรตีเอส ทางด้าน N-terminus (NS3pro) และ ส่วนที่มีคุณสมบัติเป็นเอนไซม์ RNA-stimulated nucleoside triphosphatase (NTPase)/RNA helicase (NS3h) ทางด้าน C-terminus โปรตีน NS3 มีความสำคัญต่อกระบวนการจำลองสารพันธุกรรมของเชื้อ ไวรัส โดยการอาศัยการทำงานร่วมกันระหว่างส่วนที่มีคุณสมบัติเป็นเอนไซม์ทั้งหมด แต่ยังไม่เป็นที่ทราบ แน่ชัดว่า ส่วนที่แสดงออกซึ่งคุณสมบัติของเอนไซม์ทั้งสามนั้น ต้องการการกระตุ้นในระหว่างกันและกัน หรือสามารถทำงานได้อย่างอิสระ ดังนั้น ในการศึกษานี้ จึงได้ได้ทำการสร้างพลาสมิดที่มี NS3helicase (NS3h) โปรตีน และ NS2B(H)-NS3 ฟิวชั่นยีนที่ประกอบไปด้วย NS2B บริเวณที่จำเป็นสำหรับการเร่ง ปฏิกิริยาเชื่อมต่อกับ NS3 โดยเทคนิค PCR และ การใช้เอนไซม์ตัดจำเพาะตัดยีนสังเคราะห์ และแสดงออก ในเชื้อ E. coli ซึ่งพบว่าในโปรตีน NS2B(H)NS3FL ขนาด 79.1 kDa ถูกตัดเป็นโปรตีนขนาดเล็กจำนวน มากทั้งในสภาวะอุณหภูมิ 30 องศา และ 37 องศา โปรตีนเชิงซ้อน NS3h ได้ถูกทำให้บริสุทธิ์ด้วยการแยก โครมาโตกราฟีแบบ Affinity และผ่านขบวนการคืนสภาพ (renaturation) ก่อนนำไปศึกษาปฏิกิริยาของ เอนไซม์ NTPase ด้วยวิธีการย่อยสลายสารตั้งต้น adenosine 5’-triphosphate (ATP) ในปฏิกริยา NTPase ได้โดยวิธีการวัดค่าการดูดกลืนแสงในสารละลาย malachite green พบว่าค่า Km และ kcat ของปฏิกริยา เอนไซม์ NTPase ในโปรตีน NS3h เพิ่มมากขึ้น 3 เท่าในปฏิกริยาที่มีโพลีนิวคลีโอไทด์ แสดงว่าปฏิกริยา NTPase ในโปรตีน NS3h สามารถถูกเร่งได้ด้วยโพลีนิวคลีโอไทด์ สำหรับการศึกษาปฏิกริยาของเอนไซม์ helicase โดยการแยกสายนิวคลีโอไทด์ที่ติดฉลากด้วยสีฟลูออเรสเซนต์ พบว่าสามารถวัดปฏิกริยาของ เอนไซม์ได้ในสภาวะที่ไม่มีโพลีนิวคลีโอไทด์ และไม่สามารถตรวจพบปฏิกริยา helicaseได้ในปฏิกริยาที่ มีนิวคลีโอไทด์ ทั้งหมดนี้แสดงให้เห็นว่าตำแหน่งการจับของโพลีนิวคลีโอไทด์บนเอนไซม์อาจจะเป็น ตำแหน่งเดียวกับสายนิวคลีโอไทด์ตั้งต้น

Mahidol University. Mahidol University Library and Knowledge Center

Address: NAKHONPATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Katzenmeier Gerd

Role: Thesis Advisors

Created: 2009

Modified: 2553-07-20

Issued: 2010-07-19

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

CallNumber: TH R233c 2009

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Molecular Genetics and Genetic Engineering

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4837233.pdf	3.33 MB	21	2018-05-29 15:01:26

ใช้เวลา

-0.58619 วินาที