Expression and subcellular localization of wild-type and mutant kidney anion exchanger 1 fused with Fluorescent protein and Epttope Tag

การแสดงออกและตำแหน่งที่อยู่ภายในเซลล์ของโปรตีนแอนไอออนเอ็กเซ็งเจอร์-วัน ชนิดที่พบในไตที่ปกติและผิดปกติติดด้วยโปรตีนเรืองแสงและอีพิโทปแทค

Name: Wandee Udomchaiprasertkul

MeSH: Epitopes

MeSH: Gene Expression

MeSH: Green Fluorescent Proteins

Abstract: Mutations of anion exchanger 1 (AE1) encoding kidney anion exchanger 1 (kAE1) that exchanges Cl-/HCO3 - at basolateral membrane of kidney α–intercalated cells can result in distal renal tubular acidosis (dRTA). Interestingly, almost all AE1 mutations do not cause abnormal anion transport function but usually result in impaired kAE1 trafficking to the cell membrane. AE1 G701D is a common missense mutation causing autosomal recessive (AR) dRTA in homozygous or compound heterozygous condition, frequently observed in Thai and Southeast Asian populations. A compound heterozygous AE1 G701D/SAO mutation is often found in Thai and other Southeast Asian patients with AR dRTA and ovalocytosis. The defects of mutant kAE1 proteins encoded from AE1 G701D and SAO mutations are distinct. kAE1 G701D is functional if it can traffic to the cell surface, which occurs in red cells but this will depend on the presence of glycophorin A (GPA) in Xenopus oocytes. kAE1 SAO is, however, functionally inactive although it can traffic normally to the surface of both red cells and oocytes. In cultured mammalian cells, the individually expressed kAE1 G701D and kAE1 SAO showed trafficking defect with predominantly intracellular retention. However, it is not known what would happen if kAE1 G701D and kAE1 SAO are co-expressed in cultured mammalian cells, which mimic the compound heterozygous AE1 G701D/SAO condition in human kidney cells. This study thus aimed to investigate the expression and co-expression of kAE1 SAO and kAE1 G701D in HEK293 cells by using green fluorescent protein (GFP) fusion and hemagglutinin A (HA) tagging to follow their expression and localization by confocal microscopy in both transiently and stably expressing cells. GFP-kAE1, GFP-kAE1 G701D, and GFP-kAE1 SAO fusion proteins were found to be expressed in HEK239 cells when they were initially analyzed by Western blot method. While GFP-kAE1 was co-localized with a surface marker-CD147, GFPkAE1 G701D and GFP-kAE1 SAO were intracellularly retained when they were individually expressed. Co-expression of kAE1-HA with either GFP-kAE1 G701D or GFP-kAE1 SAO could rescue cell surface expression of both mutant proteins, consistent with previous observations. In co-expression of GFP-kAE1 G701D with kAE1 SAO-HA, both mutant proteins were intracellularly retained and seemingly without cell surface expression in both transiently and stably expressing HEK293 cells, indicating their severely impaired trafficking. This is most likely the explanation for the molecular mechanism of AR dRTA associated with compound heterozygous AE1 G701D/SAO condition in patients for whom the trafficking impairment and intracellular retention of these kAE1 mutant proteins lead to the absence of functional kAE1 at the basolateral membrane of kidney α-intercalated cells

Abstract: มิวเตชั่นของยีน anion exchanger 1 (AE1) ซึ่งถอดรหัสเป็นโปรตีน anion exchanger 1 ในไต หรือ kAE1 ซึ่งทำ หน้าที่ในการแลกเปลี่ยนไอออน Cl- กับ HCO3 - ในเซลล์ขับกรดซึ่งบุท่อส่วนปลายของเนปฟอน (nephron) ในไต มีผลทำให้เกิดโรคไต ผิดปกติในการขับกรด (distal renal tubular acidosis หรือ dRTA) เป็นเรื่องที่น่าสนใจว่ามิวเตชั่นของยีน AE1 นั้นส่วนใหญ่ไม่ได้ ทำให้เกิดความผิดปกติในการแลกเปลี่ยนไอออน แต่มีผลทำให้การเคลื่อนที่ไปยังเยื่อหุ้มเซลล์ผิดปกติ โดยปกติแล้ว มิวเตชั่นชนิด G701D ทำ ให้เกิดโรคไตผิดปกติในการขับกรดที่มีการถ่ายทอดลักษณะแบบด้อย ในภาวะที่มีมิวเตชั่นชนิดนี้ชนิดเดียวแบบโฮโมซัยโกต (homozygous) และในภาวะที่มีมิวเตชั่นของยีนร่วมกันสองชนิดแบบคอมเปาต์เฮ็ทเทอโรซัยโกต (compound heterozygous) ซึ่งทั้งสองแบบนี้พบได้ บ่อยในคนไทยและในประเทศเพื่อนบ้านแถบใต้ โดยในภาวะที่มีมิวเตชั่นของยีนเดียวกันสองชนิดของ G701D กับ SAO (compound heterozygous G701D/SAO) พบได้บ่อยในผู้ป่วยไทยและแถบเอเชียอาคเนย์ ซึ่งทำให้เกิดโรคไตผิดปกติในการขับกรดที่มีการถ่ายทอด ลักษณะแบบด้อย ความผิดปกติของโปรตีน kAE1 ในไต ที่เกิดจากมิวเตชั่น G701D และ SAO นั้นแตกต่างกัน โปรตีนผิดปกติชนิด G701D จะทำหน้าที่แลกเปลี่ยนไอออนได้ปกติ เมื่อสามารถเคลื่อนที่มาที่เยื่อหุ้มเซลล์ได้ ซึ่งจะเกิดขึ้นในเม็ดเลื่อดแดง แต่ในไข่กบ (Xenopus oocytes) นั้นจะต้องมีการแสดงออกร่วมของ glycophorin A (GPA) ด้วย แต่สำหรับโปรตีนผิดปกติชนิด SAO นั้น เมื่อศึกษาในเม็ดเลือดแดงและไข่กบ โปรตีนผิดปกติไม่สามารถทำหน้าที่แลกเปลี่ยนไอออน ถึงแม้ว่าจะสามารถเคลื่อนที่มาที่เยื่อหุ้มเซลล์ได้ก็ตาม ส่วนในเซลล์เพาะเลี้ยงจากสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม โปรตีนผิดปกติชนิด G701D และ SAO มีความผิดปกติในการเคลื่อนที่ทำให้โปรตีนค้างอยู่ ภายในเซลล์ อย่างไรก็ตาม ขณะนี้ยังไม่ทราบว่าจะมีผลอย่างไร เมื่อมีการแสดงออกร่วมกันของโปรตีนผิดปกติชนิด G701D และ SAO ใน เซลล์เพาะเลี้ยงสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม ซึ่งเป็นการจำลองภาวะที่มีมิวเตชั่นของยีนเดียวกันสองชนิดของ G701D กับ SAO ในเซลล์ไตของผู้ป่วย ดังนั้นเป้าหมายของงานนี้คือเพื่อศึกษาการแสดงออกและการแสดงออกร่วมของโปรตีนผิดปกติชนิด G701D และ SAO ในเซลล์เพาะเลี้ยง จากไตของมนุษย์ (HEK293 cells) โดยการติดด้วยโปรตีนเรืองแสงสีเขียว (GFP) และ hemagglutinin A (HA) เพื่อติดตามการ แสดงออกและที่อยู่ของโปรตีนโดยใช้กล้องคอนโฟคอล โดยทำการศึกษาในเซลล์ที่มีการแสดงออกของโปรตีนแบบชั่วคราวและถาวร ผลการ ทดลองพบว่าโปรตีนปกติ โปรตีนผิดปกติชนิด G701D และ SAO ที่ติดด้วย GFP มีการแสดงออกใน HEK293 cells เมื่อศึกษาด้วยวิธี Western blot เมื่อมีการแสดงออกของโปรตีนแต่ละชนิดพบว่าในขณะที่โปรตีนปกติที่ติดด้วย GFP อยู่ที่เดียวกันกับโปรตีน CD147 ที่ ผิวเซลล์นั้น โปรตีนผิดปกติชนิด G701D และ SAO ที่ติดด้วย GFP อยู่ภายในเซลล์ เมื่อมีการแสดงออกร่วมกันของโปรตีน kAE1 ปกติที่ ติดด้วย HA กับโปรตีนผิดปกติชนิด G701D หรือ SAO ที่ติดด้วย GFP พบว่ามีการแสดงออกของโปรตีนทั้งสองที่เยื่อหุ้มเซลล์ ซึ่ง สอดคล้องกับผลของการศึกษาที่มีผู้รายงานก่อนหน้านี้ เมื่อมีการแสดงออกร่วมกันของโปรตีนผิดปกติชนิด G701D ที่ติดด้วย GFP และ SAO ที่ติดด้วย HA พบว่าโปรตีนอยู่ภายในเซลล์และดูเสมือนว่าไม่มีอยู่ที่ผิวเซลล์ ทั้งในเซลล์ที่มีการแสดงออกของโปรตีนแบบชั่วคราวและ ถาวร ชี้ให้เห็นว่ามีความผิดปกติในการเคลื่อนที่อย่างรุนแรง ซึ่งน่าจะเป็นคำอธิบายสำหรับกลไกระดับอณูของโรคไตผิดปกติในการขับกรดที่มี การถ่ายทอดแบบลักษณะด้อยอันเกิดจากมิวเตชั่น G701D กับ SAO ของ AE1 นั้นเกิดจากความผิดปกติในการเคลื่อนที่ไปผิวเซลล์และอยู่ ในเซลลืของโปรตีนผิดปกติทั้งสองทำให้ปราศจากโปรตีนที่ทำหน้าที่แลกเปลี่ยนไอออนที่เซลล์ขับกรดซึ่งบุท่อส่วนปลายของเนปฟอน nephron ของไต

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Pa-thai Yenchitsomanus

Role: Thesis Advisors

Created: 2006

Modified: 2553-06-22

Issued: 2010-06-07

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740468365

CallNumber: TH W245e 2006

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Immunology

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4536750.pdf	2.1 MB	11	2018-05-29 11:28:02

ใช้เวลา

-0.580368 วินาที