Interaction, trafficking and subcellular localization of mutant kidney anion exchanger 1 ‪(kAE1)‬proteins in cultured human embryonic kidney 293 ‪(HEK 293)‬ cells

ปฏิสัมพันธ์การเคลื่อนย้ายและตำแหน่งในเซลล์ของโปรตีนแอนไอออนเอ็กเช็งเจอร์-วัน ชนิดที่พบในไตที่ผิดปกติในเซลล์ไตเพาะเลี้ยงเอชอีเค 293

Name: Nunghathai Sawasdee

MeSH: Anion Exchange Protein 1, Erythrocyte

MeSH: Acidosis, Renal Tubular

MeSH: Heterozygote

MeSH: Protein Transport

Abstract: Mutations in anion exchanger 1 (AE1) gene may lead to defects in kAE1 protein that result in autosomal dominant (AD) and autosomal recessive (AR) distal renal tubular acidosis (dRTA), a kidney disease characterized by a defect in acid secretion of α- intercalated cells located in the distal renal tubular region. The recessive AE1 G701D mutation is frequently observed in Thai and Southeast Asian populations in homozygous condition (G701D/G701D), and also found in the form of compound heterozygote with Southeast Asian ovalocytosis (SAO) mutation (SAO/G701D), which was first identified in Thailand. The defects of kAE1 SAO and kAE1 G701D mutants have been shown to be different. The erythroid isoform of AE1 (eAE1) SAO shows an impaired anion transport activity in red cells and Xenopus oocytes, although it can be inserted into the plasma membrane. eAE1 G701D exhibits normal transport function in the red cells whereas eAE1 and kAE1 G701D lack transport activity and cell surface expression in oocytes, which can be corrected and rescued by co-expression with glycophorin A (GPA). In cultured mammalian cells, individually expressed kAE1 SAO and kAE1 G701D are retained intracellularly, showing trafficking defect. Although expression and trafficking of kAE1 SAO and G701D have been individually studied in cultured mammalian cells, no data exists on the study of co-expression between kAE1 SAO and G701D. To understand the situation that mimics compound heterozygous AE1 SAO/G701D condition resulting in AR dRTA, this study examined the trafficking and subcellular localization of the expressed and co-expressed versions kAE1, of wild-type kAE1, kAE1 SAO and G701D, and also studied the interactions between wild-type kAE1 and kAE1 SAO, wild-type kAE1 and kAE1 G701D, and kAE1 SAO and kAE1 G701D in transiently transfected human embryonic kidney 293 (HEK 293) cells. Plasmids containing either wild-type or mutant kAE1 genes all fused with the sequence of either six-histidine (6xHis), hemagglutinin (HA) or Myc epitope tag were constructed to be used in experiments. The wild-type and mutant kAE1 proteins fused with the epitope tags were expressed in HEK 293 cells, as detected by Western-blot method. When they were individually expressed, the wild-type kAE1 was localized at the cell surface, while the mutant kAE1 SAO and kAE1 G701D were intracellularly retained. Co-expressions of wild-type kAE1 with either kAE1 SAO or G701D demonstrated that they could interact to form heterodimers, and that the wild-type kAE1 could rescue the two mutant kAE1 to be expressed on the cell surface. The coexpression of kAE1 SAO and G701D showed that they could also interact but were intracellularly retained. This would most likely be a molecular mechanism of AR dRTA, associated with compound heterozygous AE1 SAO/G701D mutation in the patients, especially in the Southeast Asian populations

Abstract: มิวเตชั่นของยีน anion exchanger 1 (AE1) สามารถทำให้เกิดความผิดปกติที่โปรตีน anion exchanger 1 ชนิดที่พบในไต (หรือ kAE1) และทำให้เกิดโรคไตผิดปกติในการขับกรด ที่มีการถ่ายทอดทั้งแบบลักษณะเด่นและแบบลักษณะด้อย โรคไตชนิด นี้เกิดจากความบกพร่องในการขับกรดของเซลล์ที่ส่วนปลายของท่อฝอยในไต มิวเตชั่นของยีน AE1 ชนิด G701D มีการ ถ่ายทอดทางพันธุกรรมแบบลักษณะด้อย พบได้บ่อยในคนไทยและประชากรในเอเชียอาคเนย์ ในภาวะโฮโมซัยโกต (homozygote) และมิวเตชั่นนี้ยังพบเกิดร่วมกับมิวเตชั่นของยีน AE1 ชนิด SAO ในภาวะคอมเปาต์เฮ็ตเทอโรซัยโกต (compound heterozygous AE1 SAO/G701D) ซึ่งพบครั้งแรกในประเทศไทย อีกด้วย ความผิดปกติของโปรตีน AE1 ที่เกิดจากมิวเตชั่นชนิด SAO และ G701D นั้นแตกต่างกัน โปรตินผิดปกติชนิด SAO ไม่สามารถแลกเปลี่ยนไอออนได้ในเม็ดเลือดแดงและไข่กบ แม้ว่า โปรตีนนี้จะสามารถเคลื่อนที่มาที่เยื่อหุ้มเซลล์ได้ก็ตาม ส่วนโปรตีนผิดปกติชนิด G701D สามารถแลกเปลี่ยนไอออนได้ปกติใน เม็ดเลือดแดง แต่ไม่สามารถแลกเปลี่ยนไอออนและไม่สามารถเคลื่อนที่มาที่เยื่อหุ้มเซลล์ได้ในไข่กบ อย่างไรก็ตาม ความผิดปกติ ในการแลก เปลี่ยนไอออนและการแสดงออกที่เยื่อหุ้มเซลล์ของโปรตีนในไข่กบ กลับเป็นปกติได้ เมื่อมีการแสดงออกร่วมกับ glycophorin A (GPA) ในเซลล์เพาะเลี้ยงจากสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม โปรตีนผิดปกติชนิด SAO และ G701D ที่มีการแสดงออกแบบ เดี่ยว มีความผิดปกติเนื่องจากการคั่งค้างของโปรตีนภายในเซลล์ แสดงถึงความผิดปกติในการเคลื่อนย้ายของโปรตีน แม้ว่าการ แสดงออกและการเคลื่อนที่ของโปรตีนผิดปกติชนิด SAO และ G701D จะมีการศึกษาในเซลล์เพาะเลี้ยงจากสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม แต่ก็ยังไม่มีข้อมูลที่ทำการศึกษาการแสดงออกของโปรตีนผิดปกติชนิด SAO และ G701D ร่วมกัน เพื่อที่จะให้เข้าใจสถานภาพ จำลองของภาวะมิวเตชั่นแบบคอมเปาต์เฮ็ตเทอโรซัยโกตของ AE1 SAO/G701D ที่ทำให้เกิดโรคไตผิดปกติในการขับกรดที่ ถ่ายทอดแบบลักษณะด้อย ดังนั้นการศึกษานี้จึงได้ตรวจหาการเคลื่อนย้ายและตำแหน่งที่อยู่ภายในเซลล์ที่มีการแสดงออกแบบ เดี่ยวของโปรตีนผิดปกติชนิด SAO และ G701D และยังศึกษาปฏิสัมพันธ์กันระหว่างโปรตีนปกติกับโปรตีนผิดปกติชนิด SAO หรือ G701D โดยเฉพาะปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนผิดปกติชนิด SAO กับ G701D ในเซลล์ไตเพาะเลี้ยงชนิดเอ็ชอีเค 293 อีกด้วย พลาสมิดที่มียีน AE1 แบบปกติหรือแบบผิดปกติซึ่งติดอยู่กับลำดับนิวคลีโอไทด์ของ six-histidine (6xHis), hemagglutinin (HA) or Myc ถูกสร้างขึ้นเพื่อใช้ในการทดลอง โปรตีนชนิดปกติและผิดปกติที่ถูกทำให้มีการแสดงออกในเซลล์ไตเพาะเลี้ยงเอ็ชอีเค 293 สามารถตรวจหาโปรตีนด้วยวิธี Western blot ได้ เมื่อทำให้มีการแสดงออกของโปรตีนแต่ละชนิดแบบเดี่ยว พบว่า โปรตีน ปกติอยู่บนเยื่อหุ้มเซลล์ ส่วนโปรตีนผิดปกติชนิด SAO และ G701D ค้างอยู่ภายในเซลล์ เมื่อทำให้มีการแสดงออกร่วมกันของ โปรตีนปกติกับโปรตีนผิดปกติชนิด SAO หรือ G701D พบว่าโปรตีนเหล่านี้สามารถมีปฏิสัมพันธ์กันและสามารถปรากฏที่เยื่อ หุ้มเซลล์ แสดงว่าโปรตีนปกติช่วยทำให้โปรตีนที่ผิดปกติทั้งสองชนิดเคลื่อนย้ายไปยังเยื่อหุ้มเซลล์ ส่วนโปรตีนผิดปกติชนิด SAO และ G701D ที่ทำให้มีการแสดงออกพร้อมกันภายในเซลล์ยังคงมีปฏิสัมพันธ์กัน แต่ค้างอยู่ด้วยกันภายในเซลล์ ซึ่งน่าจะ เป็นคำอธิบายถึงกลไกที่ทำให้เกิดโรคไตผิดปกติในการขับกรดที่มีการถ่ายทอดแบบลักษณะด้อย จากมิวเตชั่นแบบคอมเเปาต์เฮ็ต เทอโรซัยโกตของ AE1 SAO/G701D ที่พบในประชากรแถบเอเชียอาคเนย์

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Pa-thai Yenchitsomanus

Role: Thesis Advisors

Created: 2006

Modified: 2553-06-22

Issued: 2010-06-07

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740473288

CallNumber: TH N972i 2006

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Immunology

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4436225.pdf	1.83 MB	11	2019-07-27 14:17:15

ใช้เวลา

0.408149 วินาที