Mimotope identification from monoclonal antibodies specific to house dust mite, using phage displayed random peptide libraries

การศึกษาค้นหา Mimotope จากโคโนโคลนอลแอนติบอดีซึ่งจำเพาะต่อไรฝุ่นโดยอาศัยห้องสมุดเปปไทด์แบบสุ่ม

Name: Nipaporn Tewawong

LCSH: Dermatophagoides pteronyssinus

LCSH: Mites -- Evolution

MeSH: Antibodies, Monoclonal

MeSH: Peptide Library

MeSH: Pyroglyphidae

Abstract: Phage display is a powerful technique for identifying peptides or interesting proteins that have desirable binding properties. In this study, random heptapeptide T7 with cysteine flanking library, and random 12mer M13 phage library, were used to identify mimotopes that bind to six monoclonal antibodies (MAbs) specific to the house dust mite, respectively. T7 and M13 phage that bind to MAbs were selected and amplified by biopanning process. The select bound phages were tested for binding specificity against MAbs by indirect ELISA and Western blot. The DNA of the selecting bound phages was amplified and sequenced by PCR and DNA sequencing. Selected bound phages T7/B4 were Western blot positive with MAb specific to the house dust mite and with positive band for molecular weight 42.6 kDa. Altogether, 47 mimotopes were aligned with the similar peptide allergen, using the Structural Database of Allergenic Proteins (SDAP). Eight mimotopes (17.4%) that partially matched Der f 15 allergen predominated followed by Eur m 14 allergen (13.04%) and Per a 3.0202 allergen (10.87%). Various mimotopes matched with Der f 15; Eur m 14 and Per a 3.0202 were aligned. Especially Der f 15 allergen, the amino acid regions 411-429 and 480-503, correlated with overlapping mimotopes and seemed to be the main epitope clusters of the Der f 15 allergen peptide. The alignment of the sequences obtained from T7/B3 (3 mimotopes) and T7/B2 (1 mimotope) revealed a common motif SXTPXXTXYXD. The two sequences (Asn66-Leu67, Ser71-Leu72, Glu74- Phe75), one sequence (Thr41-Pro42, Gln46-Gly48) from MAb B2 and (Asn63, Lys65, Ala67) from MAb B1 were located on the surface protein structures of Der p 1 and Der f 2, respectively. Using BLASTP software, the predominant mimotopes were LTPCDP, which matched with dumpy CG33196-PB protein of D. melanogaster, found in 4 phages (8.5%), followed by the CLPYE match with the LD38710p protein of D. melanogaster, found in 3 phages (6.3%). The mimotope PCCP matched peptide toxin 4 precursor protein of M. gigas, mimotopes TPCNNLKKR, CPCYPKK, and GEMEGL, matched putative salivary secreted protein of I. scapularis, and mimotope LTPCDP matched with dumpy CG33196- PB protein of D. melanogaster, located extracellular at 66.7, 55.6, 44.4, 43.5 and 26.1% of these mimotopes, respectively. Using phage display technique, mimotope from MAbs specific to the house dust mite could be successfully identifie

Abstract: เทคโนโลยีการแสดงออกของเปปไทด์บนผิวไวรัสเป็นวิธีการที่มีประโยชน์มาก สามารถนำมาใช้ในการค้นหา เปปไทด์หรือโปรตีนที่เราสนใจโดยอาศัยคุณสมบัติการจับกันอย่างเหมาะสมระหว่างโมเลกุลคู่หนึ่ง ในการศึกษาครั้งนี้มี วัตถุประสงค์เพื่อใช้ห้องสมุดเปปไทด์แบบสุ่ม T7 และ M13 ในการค้นหามิโมโทปจากโมโนโคลนอลแอนติบอดี 6 ตัวอย่างซึ่งจำเพาะต่อไรฝุ่น ห้องสมุดเปปไทด์แบบสุ่ม T7 และ M13 ซึ่งจับกับโมโนโคลนอลแอนติบอดีอย่างจำเพาะจะ ถูกคัดเลือกและเพิ่มจำนวนโดยวิธี biopanning ฟาจที่ถูกคัดเลือกทั้ง 10 ตัวอย่างจะถูกทดสอบการจับกับโมโนโคลนอล แอนติบอดีที่จำเพาะกับไรฝุ่นโดยวิธี ELISA และ Western blot หลังจากนั้นฟาจที่ได้รับคัดเลือกจะถูกเพิ่มจำนวน ดีเอ็นเอโดยวิธี PCR และทำการวิเคราะห์เปปไทด์โดยการหาลำดับเบส ฟาจที่ได้จาก T7/B4 ให้ผลบวกกับโมโนโคลนอล แอนติบอดีที่จำเพาะกับไรฝุ่นด้วยวิธี Western blot ซึ่ง band ที่เกิดมีน้ำหนักโมเลกุล 42.6 kDa จากการหาลำดับเบส ของฟาจพบว่ามิโมโทปจากฟาจ M13/B6 ซึ่งมีลำดับกรดอะมิโน AERWGPWGVHSW มีความคล้ายคลึงกับ เปปไทด์ที่จับกับจานพลาสติก ELISA และเมื่อนำมิโมโทปที่ได้ทั้ง 47 ตัวอย่างไปเปรียบเทียบกับเปปไทด์ของสาร ก่อภูมิแพ้ในฐานข้อมูลของ SDAP พบว่ามิโมโทปจากฟาจส่วนใหญ่มีลำดับกรดอะมิโนบางส่วนที่เหมือนกับลำดับกรด อะมิโนของสารก่อภูมิแพ้ Der f 15 (17.4%) Eur m 14 (13.04%) และ Per a 3.0202 (10.87%) นอกจากนี้เมื่อ พิจารณาการเรียงตัวของลำดับกรดอะมิโนของสารก่อภูมิแพ้ Der f 15 พบมิโมโทปจำนวน 5 ตัวอย่างมีการเรียงตัวของ กรดอะมิโนที่ตำแหน่ง 411-429 และ 480-503 และลำดับกรดอะมิโนของมิโมโทปที่ได้จากฟาจ T7/B3 (3 มิโมโทป) และ T7/B2 (1 มิโมโทป) มีการเรียงตัวในรูปแบบเดียวกัน คือ SXTPXXTXYXD มิโมโทปจากฟาจ T7/B2 ที่มี ลำดับกรดอะมิโน (Asn66-Leu67, Ser71-Leu72, Glu74-Phe75) (2 มิโมโทป) และThr41-Pro42, Gln46- Gly48 (1 มิโมโทป) และมิโมโทปจากฟาจ T7/B1 ที่มีลำดับกรดอะมิโน Asn63, Lys65, Ala67 (1 มิโมโทป) มี ตำแหน่งอยู่บนผิวโครงสร้างโปรตีนของสารก่อภูมิแพ้ Der p 1 และ Der f 2 ตามลำดับ จากการใช้โปรแกรม BLASTP พบว่ามิโมโทป LTPCDP และ CLPYE มีลำดับกรดอะมิโนเหมือนกับโปรตีน CG33196-PB (8.5%) และ LD38710p (6.3%) ของแมลงหวี่ ตามลำดับ และจากโปรแกรม PSORT II ที่ใช้สำหรับทำนายจุดกำเนิดและตำแหน่ง ของโปรตีนที่ถูกหลั่งออกมาจากเซลล์พบว่ามิโมโทป PCCP ซึ่งมีลำดับกรดอะมิโนเหมือนกับโปรตีนตั้งต้นของพิษแมงมุม มิโมโทป TPCNNLKKR, CPCYPKK และ GEMEGL ซึ่งมีลำดับกรดอะมิโนเหมือนกับโปรตีนของน้ำลายเห็บ และมิโมโทป LTPCDP ซึ่งมีลำดับกรดอะมิโนเหมือนกับโปรตีน CG33196-PB ของแมลงหวี่ โปรตีนเหล่านี้หลั่งมา จากภายนอกเซลล์คิดเป็น 66.7, 55.6, 44.4, 43.5 and 26.1% ตามลำดับ จากการวิจัยครั้งนี้เป็นการแสดงให้เห็นถึง ศักยภาพในการประยุกต์ใช้เทคโนโลยีการแสดงออกของเปปไทด์บนผิวไวรัสเพื่อค้นหามิโมโทปจากโมโนโคลนอลแอนติ - บอดีที่จำเพาะต่อไรฝุ่น

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Pongrama Ramasoota

Role: Thesis Advisors

Created: 2006

Modified: 2553-06-24

Issued: 2010-06-05

ISBN: 9740477313

CallNumber: TH N719m 2006

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Tropical Medicine

Grantor: Mahidol University

©copyrights

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4737007.pdf	1.58 MB	24	2020-07-28 18:34:41

ใช้เวลา

0.225626 วินาที