Using Palaya Ringsport virus ‪(PRSV)‬ as an antigen presentation system

การใช้ไวรัสโรคใบด่างจุดวงแหวนในมะละกอเพื่อผลิตและนำเสนอแอนติเจนแปลกปลอมอย่างเป็นระบบ

Name: Supawat Chatchen

LCSH: Plant Diseases

MeSH: Antigen Presentation

MeSH: Epitopes

MeSH: Parvovirus, Canine

Abstract: Papaya ringspot virus (PRSV) causes a serious disease of papaya in many countries including Thailand. PRSV is considered to be a candidate for expressing a foreign antigen. PRSV coat protein (CP) can be used as a carrier molecule to present a foreign antigen. The CP is characterized into three major parts: the core region responsible for protein folding, and the N and C terminal regions, which are exposed to the surface. In this study, the Canine parvovirus (CPV) VP2 epitope is used as a model antigen due to its well-characterized antigenic properties and small size of only 15 amino acids. Construction of the full-length PRSV cDNA clones enables the modification of the PRSV for introducing CPV epitope. The aims of this thesis were to generate chimeric infectious clones of PRSV-CPV as well as to evaluate the positional effect of CP-CPV in the E. coli system. Several expression plasmids containing the wild-type of cp gene and modified cp-cpv genes were constructed (pSA1299, pSA1300, pSA1301, pSA1302 and pSA1303). The modified CP-CPV fusion proteins were purified and used for intraperitoneal injection into mice. The immunogenicity of the modified CP-CPV was characterized by NCM-ELISA analysis comparing with the anti CPV monoclonal antibody (3C9). Sera from group of, pSA1301 and pSA1302, containing CPV epitope inserted at the position on the C-terminus or both N and C-termini can trigger the mouse immune response more efficient than the epitope inserted at N-terminus or the epitope substitution at the C-terminus. Five chimeric full-length PRSV-CPV cDNA under the control of partially duplicated CaMV 35S promoter and NOS terminator were constructed. No symptoms were observed using particle gun bombardment inoculation of tested plants with pSA1335, pSA1359, pSA1360 and pSA1384. Only the pSA1385, obtained by inserting the CPV epitope sequence and HindIII site at the end of the cp gene, generated the infection symptom on the inoculated zucchini. However, the introduced HindIII site was not detected by the RT-PCR and restriction analysis. A similar result was also observed from the pSA1388 inoculated plants. The sequencing result revealed the same sequence as original pSA1164 in the modified region. The CPV epitope inserted at the C-terminus of PRSV CP exhibited the strongest immune response. The result from the modification of infectious PRSV cDNA produced in this study implied that modification on PRSV sequence can affect its infectivity and contamination of the original clone pSA1164 may cause infection in the pSA1385 and pSA1388 bombarded plants

Abstract: ไวรัสโรคใบด่างจุดวงแหวนในมะละกอเป็นสาเหตุของโรคที่สำคัญในมะละกอในหลายประเทศรวมถึง ประเทศไทย ไวรัสนี้เป็นที่สนใจและมีศักยภาพในการพัฒนาไว้เพื่อการผลิตแอนติเจนแปลกปลอมจากสิ่งมีชีวิต อื่น โปรตีนเปลือกนอกของไวรัสนี้ถูกแบ่งออกเป็นสามส่วน ส่วนตรงกลางนั้นจะมีหน้าที่สำหรับการคดตัวของ โปรตีนและส่วนหน้ากับหลังจะยื่นออกมาที่ผิวไวรัส ในการศึกษาครั้งนี้ VP2 epitope ของ Canine Parvovirus (CPV) ได้ถูกเลือกใช้เป็นแอนติเจนต้นแบบเพราะมีคุณลักษณะและขนาดที่เล็ก การสร้าง cDNA ของไวรัสนี้ทำให้ สามารถเพิ่มจำนวนไวรัสและใช้ในการสร้าง CVP epitope ปริมาณมาก จุดมุ่งหมายของการศึกษานี้เพื่อสร้าง chimeric infectious clone ของไวรัส PRSV-CPV และศึกษาตำแหน่งที่เหมะสมบนยีนเปลือกไวรัสเพื่อนำเสนอ ของโปรตีนเปลือกนอกนี้ในระบบของ E. coli งานวิจัยนี้ได้สร้าง 5 พลาสมิด ทั้งพลาสมิดที่ประกอบด้วยโปรตีนเปลือกนอกแบบปกติและแบบที่ได้ เพิ่ม CVP epitope เข้าไปคือ pSA1299, pSA1300, pSA1301, pSA1302 และ pSA1303 โปรตีนเปลือกนอกนี้ได้ถูก แยกและทำให้บริสุทธิ์ก่อนนำมาใช้ในการฉีดเข้าไปในหนู ตรวจสอบการสร้างภูมิคุ้มกันต่อ CVP epitope ด้วยวิธี NCM-ELISA โดยเทียบกับแอนติบอดีที่จำเพาะที่เรียกว่า 3C9 เซรุ่มของหนูจากกลุ่มที่ได้ฉีด pSA1301 และ pSA1302 เข้าไปซึ่งได้เพิ่ม CVP epitope ที่ส่วนหลังหรือทั้งส่วนหน้าและส่วนหลังสามารถที่จะกระตุ้นระบบ ภูมิคุ้มกันได้อย่างมีประสิทธิ์ภาพมากกว่าแบบที่ได้เพิ่ม CVP epitope ที่ส่วนหน้าหรือแบบที่ได้สลับที่ส่วนหลัง การทดสอบการก่อโรคในพืชโดยใช้พลาสมิดที่มี cDNA ลูกผสมระหว่าง PRSV-CPV ควบคุมโดยโปร โมเตอร์ CaMV 35S แบบ partially duplicated และ NOS terminator พบว่าไม่ก่อให้เกิดโรคในพืชทดสอบเมื่อใช้ วิธี particle gun bombardment กับ pSA1335, pSA1339, pSA1360 และ pSA1384 แค่ pSA1385 ที่มีการเพิ่ม CVP epitope และตำแหน่ง HindIII เข้าไปที่ท้ายของยีนโปรตีนเปลือกนอกสามารถทำให้ zucchini บางต้นมีอาการโรค การตรวจสอบด้วยวิธี RT-PCR และ restriction analysis ไม่พบส่วนของยีนที่ใส่เข้าไปในไวรัส นอกจากนี้ ผลที่ คล้ายกัน ยังเกิดขึ้นในพืชทดสอบกับ pSA1388 จากการพิจารณาลำดับเบสของไวรัส แสดงให้เห็นว่า เหมือนกับ พลาสมิดตั้งต้น pSA1164 ในช่วงที่มีการเพิ่มยีนอื่นใส่เข้าไป การทดลองนี้แสดงว่า การใส่ยีนแอนติเจนที่ส่วนหลังของโปรตีนเปลือกนอกทำให้มีการกระตุ้นระบบ ภูมิคุ้มกันในหนูได้ดีกว่าตำแหน่งส่วนหน้า แต่การใส่ยีนดังกล่าวเข้าไปในไวรัส ทำให้ความสามารถในการก่อโรค ในพืชของไวรัสสูญเสียไป และการปนมาของพลาสมิดตั้งต้น pSA1164 อาจจะเป็นสาเหตุของการเกิดโรคในพืช ทดสอบกับ pSA1385 และ pSA1388

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Sunee Kertbundit

Role: Thesis Advisors

Created: 2006

Modified: 2553-06-14

Issued: 2010-06-01

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740471714

CallNumber: TH S959u 2006

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Molecular Genetics and Genetic Engineering

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4337456.pdf	4.01 MB	16	2018-05-16 13:39:23

ใช้เวลา

-0.64438 วินาที