Biochemical analysis of the NS2B‪(H)‬-NS3‪(PRO)‬ serine protease from four dengue virus serotypes

การวิเคราะห์ความแตกต่างเชิงชีวเคมีของเอนไซม์ซีรีนโปรตีนเอสคอมเพล็กซ์ NS2B‪(H)‬-NS3‪(PRO)‬ จากไวรัสไข้เลือดออกสราซีโรไทป์

Name: Tawin Iempridee

LCSH: Proteolytic enzymes

MeSH: Dengue Virus

MeSH: Serine Proteinases

Abstract: Dengue viruses consist of a group of four serologically related viruses referred to as dengue virus serotypes 1-4, characterized by large genetic and immunological distances. Virus-encoded two-component protease NS2B-NS3 specifically mediates processing of the viral polyprotein, liberating individual proteins from the precursor. Amino acid sequence analysis of the NS2B cofactor region and NS3 protease domain from four serotypes reveals the relatively low sequence identity. This genetic divergence may lead to changes in functional properties. This thesis study is therefore aimed to elucidate biochemical and kinetic properties of the protease complexes from four dengue virus serotypes. An active form of protease complexes of four serotypes encompassing the NS2B hydrophilic domain linked to the NS3 protease domain, NS2B(H)-NS3(pro), were constructed by RT-PCR and SOE-PCR. Recombinant proteins were expressed in Escherichia coli and purified by metal chelate affinity chromatography followed by size-exclusion chromatography under denaturing conditions. Renaturation of precursors, mediated by artificial chaperoneassisted refolding yielded the active proteases evidenced by their autoprocessing at the NS2B/NS3 site. Proteolytic activity of DEN-2, 3 and 4 proteases was assessed using a fluorogenic substrate, Boc-G-R-R-AMC. Enzymes were active-site titrated, and measured velocities were corrected for the inner filter effect. Kinetic studies revealed a comparable Km value whilst the kcat was significantly different. The rank order for catalytic efficiency (kcat/Km) was DEN-4 (4,554.6 ± 169.2 M-1s-1) > DEN-2 (2,904.7 ± 30.7 M-1s-1) > DEN-3 (1,490.9 ± 65.9 M-1s-1). Stability assays also demonstrated drastic differences in half-life (t1/2) at 50°C with the highest stability in DEN-2 (247.0 ± 0.8 min) followed by DEN-3 (70.3 ± 5.0 min) and DEN-4 (21.4 ± 1.8 min). However, all proteases shared close proximity in pH and ionic strength dependence as well as their overall tertiary structure as determined by fluorescence spectroscopy. These novel findings make an inference that genetic diversity of protease complexes among the multiple serotypes of dengue viruses has led to marked differences in thermostability and proteolytic efficiency while retaining a structural conservation, suggesting an adaptation of these serotypes to distinct selection pressures, thereby increasing viral fitness

Abstract: เอนไซม์โปรตีเอสคอมเพล็กซ์ NS2B(H)-NS3 ของไวรัสไข้เลือดออกมีความสำคัญในขบวนการเพิ่มจำนวนของเชื้อไวรัสเนื่องจากทำหน้าที่ตัดสายโพลีโปรตีนของไวรัสให้เป็น โปรตีนแต่ละชนิดซึ่งทำงานได้ จากการวิเคราะห์ลำดับกรดอะมิโนของโปรตีน NS2B ในบริเวณโคแฟคเตอร์ และ NS3 บริเวณโปรตีเอสของไวรัสไข้เลือดออกซีโรไทป์ 1 2 3 และ 4 พบว่ามีความอนุรักษ์ต่ำซึ่งอาจส่งผลให้เกิดความแตกต่างในสมบัติทางชีวเคมีของเอนไซม์ ในการศึกษาครั้งนี้ได้ทำการสร้างพลาสมิดที่มี NS2B(H)-NS3(pro) ฟิวชั่นยีนที่ประกอบไปด้วย NS2B บริเวณที่จำเป็นสำหรับการเร่งปฏิกิริยาเชื่อมต่อกับ NS3 บริเวณโปรตีเอสจากไวรัสไข้ เลือดออกทั้งสี่ซีโรไทป์โดยเทคนิค RT-PCR และ SOE-PCR และแสดงออกในเชื้อ E.coli ซึ่งโปรตีนเชิงซ้อนดังกล่าวได้ถูกทำให้บริสุทธิ์ด้วยการแยกโครมาโตกราฟีแบบ Affinity และ Gel-filtration และผ่านขบวนการคืนสภาพ(renaturation) ก่อนนำไปศึกษาปฏิกิริยาการย่อยกับสับสเตรท Boc-G-R-R-AMC ซึ่งติดฉลากด้วยสารเรืองแสง พบว่าค่า Km ของโปรตีเอสของไวรัสไข้เลือดออกซีโรไทป์ 2 3 และ 4 ใกล้เคียงกันแต่ค่า Kcat มีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ ส่งผลให้ประสิทธิภาพการเร่งปฏิกิริยา Kcat/Km มีค่ามากที่สุดในซีโรไทป์ 4 (4,554.6 ± 169.2 M-1s-1)ตามด้วยซีโรไทป์ 2 (2,904.7 ± 30.7 M-1s-1) และซีโรไทป์ 3 (1,490.9 ± 65.9 M-1s-1) ตามลำดับ นอกจากนี้เมื่อศึกษาความเสถียรของเอนไซม์ต่ออุณหภูมิพบว่าค่าครึ่งชีวิต (t1/2) ที่ 50°C แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญโดยโปรตีเอสของซีโรไทป์ 2 (247.0 ± 0.8 min) มีความเสถียรมากกว่าซีโรไทป์ 3 (70.3 ± 5.0 min) และซีโรไทป์ 4 (21.4 ± 1.8 min) ตามลำดับ อย่างไรก็ตามเอนไซม์ทุกซีโรไทป์มีรูปแบบการตอบสนองต่อค่า pH และ ionic strength ที่เหมือนกัน รวมไปถึงโครงสร้างตติยภูมิของเอนไซม์ การศึกษาทั้งหมดนี้แสดงให้เห็นว่าวิวัฒนาการลู่ออกของเอนไซม์โปรตีเอสของไวรัสไข้เลือดออกในแต่ละซีโรไทป์นำไปสู่ความแตกต่างของประสิทธิภาพการทำงานและเสถียรภาพของเอนไซม์ โดยยังคงอนุรักษ์โครงสร้างสามมิติไว้

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Katzenmeier, Gerd

Role: Thesis Advisors

Created: 2005

Modified: 2553-06-11

Issued: 2010-04-26

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740457495

CallNumber: TH B234t 2005

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Molecular Genetics and Genetic Engineering

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4536661.pdf	10.61 MB	16	2026-05-26 18:16:01

ใช้เวลา

-0.729313 วินาที