Dihydrofolate reductase of plasmodium falciparum : effects of junctional peptide on enzyme kinetics

เอ็นไซน์ไดไฮโดรโฟเลท รีดักเตส ของเชื้อมาลาเรียฟัลซิปารั่ม : การศึกษาผลกระทบของเปปไทด์เชื่อมที่มีต่อจลศาสตร์ของเอ็นไซม์

Name: Napaporn Winijnaiyapark

LCSH: Enzyme kinetics

LCSH: Plasmodium falciparum

Abstract: Dihydrofolate reductase and thymidylate synthase are two essential enzymes in the de novo synthesis of thymidylate required for DNA synthesis. In a malaria parasite, Plasmodium falciparum, these two enzymes exist as a bifunctional protein and are linked by a junction region. The junction of these two enzymes in P. falciparum is an important drug target of antifolate antimalarials such as pyrimethamine and cycloguanil in malarial chemotherapy. A thorough understanding of the enzyme structure and its interaction with antifolates would aid in the development of new antifolates effective against resistant malaria. Comparative analysis of the kinetic properties of dihydrofolate reductase and the kinetics of the enzyme with junction peptides of varying lengths would be a possible means to investigate their effects on the enzyme’s properties. The goal of this study was to investigate the roles of the junction region on the catalytic activity and kinetic properties of dihydrofolate reductase in P. falciparum. I have constructed four recombinant clones of genes encoding for this enzyme containing different lengths of junction peptides extending toward the carboxyl-terminus of this enzyme. Expression and purification of the recombinant proteins in E. coli was performed. Kinetic studies and inhibition by antifolates were carried out on the recombinant proteins and the results obtained were compared to those of the dihydrofolate reductase in P. falciparum. My results showed that the presence of junction peptide extending toward the carboxyl-terminal of the dihydrofolate reductase in P. falciparum did not improve the level of expression of the enzyme nor affect its stability. The kinetic properties of enzymes with different lengths of junction peptides were comparable to those of the dihydrofolate reductase in P. falciparum.

Abstract: ไดไฮโดรโฟเลตรีดักเตส (DHFR) และไทมิไดเลต ซินเทส (TS) เป็นเอ็นไซม์ที่มีความสำคัญในกระบวนการสร้างไทมิไดเลตซึ่งเป็นสารตั้งต้นที่สำคัญในการสังเคราะห์สารพันธุกรรมดีเอ็นเอ ในเชื้อมาลาเรียฟัลซิปารั่ม (Plasmodium falciparum) เป็นที่ทราบกันว่าเอ็นไซม์ทั้งสองอยู่บนสายโปลีเปปไทด์เดียวกัน และเชื่อมต่อกันโดยมีสายเปปไทด์สั้นๆ (Junctional Region, JR) ซึ่งเชื่อมต่อระหว่างเอ็นไซม์ทั้งสอง เอ็นไซม์ DHFR-TS เป็นเอ็นไซม์เป้าสำคัญของยาบำบัดมาลาเรียที่สำคัญเช่นไพริเมธามีนและไซโครกัวนิว ดังนั้นองค์ความรู้ที่นำไปสู่ความเข้าใจด้านโครงสร้างของเอ็นไซม์ ปฏิสัมพันธ์ระหว่างเอ็นไซม์กับยาจึงน่าที่จะเป็นประโยชน์ต่อการพัฒนายาใหม่ให้สามารถออกฤทธิ์ต่อเชื้อที่ดื้อยาได้ การศึกษาคุณสมบัติของเอ็นไซม์ DHFR เปรียบเทียบกับเอ็นไซม์ DHFR ที่มีส่วนของ JR ที่มีความยาวต่างๆ กันทางด้านปลายคาร์บอกซีของ DHFR จึงเป็นแนวทางหนึ่งในการศึกษาบทบาทหน้าที่ของบริเวณ JR คณะผู้วิจัยต้องการที่จะศึกษาบทบาทของส่วนของเปปไทด์เชื่อมที่มีต่อการเร่งปฏิกิริยาและคุณสมบัติทางจลศาสตร์ของเอ็นไซม์ DHFR จึงได้ทำการสร้างโคลนและแสดงออกยีนในส่วนของDHFR ซึ่งมีส่วนของเปปไทด์เชื่อมขนาดต่างๆ ทางด้านปลายคาร์บอกซีของเอ็นไซม์จำนวน 4 โคลน และทำการแสดงออกในเชื้อแบคทีเรียอี โคไล และทำการศึกษาจลศาสตร์ของเอ็นไซม์บริสุทธิ์และการยับยั้งเอ็นไซม์ที่ได้จากโคลนเหล่านี้ จากผลการทดลองพบว่าการที่มีส่วนเปปไทด์เชื่อมขนาดต่างๆ กันที่ปลายด้านคาร์บอกซีของ DHFR ไม่ได้ช่วยเพิ่มระดับของการแสดงออกของยีนหรือสามารถทำให้เอ็นไซม์มีความเสถียรขึ้นเมื่อเทียบกับคุณสมบัติของเอ็นไซม์ที่มีเพียงส่วนของ DHFR อย่างเดียว ผลการศึกษาแสดงให้เห็นว่าเอ็นไซม์ DHFR ที่มี JR ต่ออยู่ที่ปลายคาร์บอกซีมีคุณสมบัติทางจลศาสตร์คล้ายกับเอ็นไซม์ pfDHFR

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Worachart Sirawaraporn

Role: Thesis Advisors

Created: 2004

Modified: 2553-03-16

Issued: 2010-02-09

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740447759

CallNumber: TH N195d 2004

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Biochemistry

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4336163.pdf	1.93 MB	17	2019-01-05 12:27:36

ใช้เวลา

0.419025 วินาที