Autosomal dominant polycystic kidney disease ‪(ADPKD)‬ : a molecular study of PKD1 gene in Thai patients

โรคถุงน้ำในไตชนิดถ่ายทอดแบบลักษณะเด่น ‪(ADPKD)‬ : การศึกษาระดับโมเลกุลของยีน PKD1 ในผู้ป่วยไทย

Name: Duangkamon Bunditworapoom

MeSH: Kidney, Polycystic

MeSH: Mutation

MeSH: Polymorphism (Genetics)

MeSH: Polymorphism, Restriction Fragmmet Length

MeSH: Polymorphism, Single-Stranded Conformational

Abstract: Autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) is a common genetic disorder in humans. PKD1 is the major responsible gene, accounting for 85% of ADPKD cases. This gene comprises a long reiterated sequence at 5’ part, causing difficulty in its molecular study. PKD1 encodes an integral membrane protein, polycystin-1, which is thought to have a function in cell-cell and cell-matrix interaction. To date, more than 250 PKD1 mutations have been identified without a particular hot spot on the gene. However, from most of the data generated by the studies of Western ADPKD patients; very few were reported from Thai patients. In the present study, ten unrelated Thai ADPKD patients were examined for PKD1 mutations and polymorphisms. Long reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) amplification of the full-length PKD1-specific mRNA transcripts (13.6 kb) from lymphocytes followed by generation of nine overlapping nested-PCR product were performed for analysis of the entire coding region of PKD1. Multiple restriction fragment-single strand conformation polymorphism (MRF-SSCP) technique was developed for screening mutation in the nested-PCR products. The mutations and polymorphisms identified from the analysis of cDNA were confirmed by examination of genomic DNA, using the long-range PCR (LR-PCR) for amplifications of PKD1-specific regions, encompassing either exons 2-13 (7,508 bp) or exons 14-33 (18,099 bp), followed by nested PCR of the interested region and direct DNA sequencing. Three PKD1 mutations were identified in this study, two of which were known splicing defect, IVS13-2A>T and frameshift deletion, c.5225_5226delAG in exon 15, and one was a novel in-frame deletion, L3287del, in exon 29. All mutations were located in the reiterated part of PKD1 gene. The splicing defect, IVS13-2A>T previously identified in a Thai family PK015 was directly detected by allele specific amplification (ASA) in family PK035 in the present study. Different haplotypes associated with this mutation in two families indicates their different ancestral origins. A frameshift deletion (c.5225_5226delAG) previously reported in Caucasian was found in all patients of family PK039, resulting in frameshift translation beginning at codon 1672 and premature stop at codon 1768. This mutation could be directly detected either by restriction analysis with Eco0109 I or by heteroduplex analysis (HA) in the SSCP gel. An in-frame deletion (L3287del) found in family PK002 occurred at the highly conserved leucine in the second transmembrane domain of polycystin-1. The L3287del mutation could be detected in members of family PK002 by HA. Most affected persons in this family had early onset of the disease which appeared sooner in the next generation. In addition, seven single nucleotide polymorphisms (SNPs) (six novel and one reported) were identified in this study. The known SNP was found to be linked with the disease phenotype in one large PKD1 family (PK007) which variance was instrumental for tracking the disease allele in this family.

Abstract: โรคถุงน้ำในไตชนิดถ่ายทอดแบบลักษณะเด่นเป็นโรคพันธุกรรมที่มีความผิดปกติที่ไตที่พบได้บ่อยในมนุษย์ มียีน PKD1 เป็นสาเหตุสำคัญของการเกิดโรคในผู้ป่วย ADPKD ร้อยละ 85 ลำดับเบสส่วนใหญ่นับจากด้านปลาย 5’ ของยีนนี้ มีความซ้ำซ้อน กับยีนอื่นทำให้เป็นปัญหาในการศึกษาระดับอณู ยีน PKD1 ถอดรหัสเป็นโปรตีนของเยื่อหุ้มเซลล์ชื่อ polycystin-1 ซึ่งเชื่อกันว่ามี หน้าที่เกี่ยวกับปฏิสัมพันธ์ระหว่างเซลล์ด้วยกันหรือเซลล์กับ matrix ปัจจุบัน มีการค้นพบมิวเตชั่นในยีน PKD1 มากกว่า 250 ชนิด ซึ่งมักเกิดไม่ซ้ำที่กัน อย่างไรก็ดี มิวเตชั่นส่วนมากเป็นข้อมูลจากผู้ป่วย ADPKD ชาวตะวันตก ขณะที่มีรายงานในผู้ป่วยไทยเพียง ไม่กี่ชนิด ในงานวิจัยนี้ได้ทำการศึกษามิวเตชั่นและ polymorphism ในผู้ป่วย ADPKD ชาวไทยที่ไม่ได้เป็นญาติกันจำนวน 10 ราย เพื่อทำการวิเคราะห์ลำดับเบสให้ได้ตลอดทั้งยีนจึงได้ใช้วิธี long reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) (ขนาด 13.6 กิโลเบส) ในการเพิ่มปริมาณ cDNA ของยีน PKD1 ที่ครบสมบูรณ์ซึ่งสังเคราะห์ได้จาก mRNA ในเซลล์เม็ดเลือดขาว ลิมโฟซัยต์ ก่อนนำไปแยกเป็น 9 ชิ้นย่อยที่เหลื่อมกันด้วยวิธี nested PCR นอกจากนี้ยังได้พัฒนาวิธี multiple restriction fragment single strand conformation polymorphism (MRF-SSCP) สำหรับการตรวจกรองมิวเตชั่นใน cDNA ชิ้นย่อยทั้งหมด ผลที่ได้จาก การศึกษาในอาร์เอ็นเอมีการพิสูจน์ยืนยันด้วยการตรวจดีเอ็นเอ โดยใช้วิธี long-range PCR (LR-PCR) เพื่อเพิ่มปริมาณแม่แบบดีเอ็น เอที่จำเพาะกับยีน PKD1 ตั้งแต่ exon 2-13 (ขนาด 7,508 คู่เบส) และ exon 14-33 (ขนาด 18,099 คู่เบส) ก่อนทำ nested PCR และ วิเคราะห์ลำดับเบสในบริเวณที่สนใจ งานวิจัยนี้พบมิวเตชั่นในยีน PKD1 3 ชนิดซึ่งมี 2 ชนิดเคยถูกรายงานไว้แล้ว (IVS13-2A>T และ c.5225_5226delAG ใน exon 15) และอีก 1 ชนิดยังไม่เคยมีรายงานมาก่อน (L3287del ใน exon 29) มิวเตชั่นทั้งหมดอยู่ในบริเวณที่เป็นลำดับเบสซ้ำซ้อน ในยีน PKD1 มิวเตชั่นชนิดที่ทำให้เกิดความผิดปกติในการตัดต่ออาร์เอ็นเอ คือ IVS13-2A>T ซึ่งเคยถูกรายงานไว้ในผู้ป่วยชาวไทย ครอบครัว PK015 นั้น สามารถตรวจพบได้โดยตรงด้วยวิธี allele specific amplification (ASA) ในครอบครัว PK035 ที่ศึกษาครั้งนี้ จากการวิเคราะห์ haplotype ของทั้งสองครอบครัวนี้ (PK015 และ PK035) พบว่าแตกต่างกัน แสดงว่าการถ่ายทอดมิวเตชั่นชนิด เดียวกันนี้มาจากต่างบรรพบุรุษกัน ส่วนมิวเตชั่นชนิดที่มีการขาดหายของลำดับเบสแบบ frameshift (c.5225_5226delAG) ที่พบใน ผู้ป่วยครอบครัว PK039 นั้น เคยมีรายงานมาก่อนในคอเคเชี่ยน ทำให้การแปลรหัสโปรตีนเลื่อนไปตั้งแต่กรดอะมิโนตัวที่ 1672 และเกิดรหัสหยุดก่อนกำหนดที่ตำแหน่ง 1768 มิวเตชั่นนี้สามารถตรวจได้โดยตรงโดยการย่อยด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ Eco0109 I หรือโดยการวิเคราะห์ heteroduplex (HA) ในเจลที่ใช้สำหรับวิเคราะห์ SSCP ส่วนมิวเตชั่นชนิดที่มีการขาดหายของลำดับเบสแบบ inframe (L3287del) ที่พบในครอบครัว PK002 นั้น ได้ทำให้สูญเสียกรดอะมิโน leucine ซึ่งอยู่ในบริเวณ transmembrane ที่ 2 ของ โปรตีน polycystin-1 ที่ถูกอนุรักษ์ไว้ในสิ่งมีชีวิตหลายชนิด การตรวจหามิวเตชั่นชนิด L3287del โดยตรงในสมาชิกครอบครัว PK002 สามารถทำได้โดยใช้วิธี HA เป็นที่น่าสังเกตว่าผู้ป่วยส่วนใหญ่ในครอบครัวนี้แสดงอาการของโรคเมื่ออายุยังน้อยและดู เหมือนว่าอาการจะปรากฏเร็วขึ้นในรุ่นหลัง นอกเหนือจากมิวเตชั่นที่พบดังกล่าวแล้ว งานวิจัยนี้ยังพบ single nucleotide polymorphism (SNPs) ของยีน PKD1 อีก 7 ชนิด (6 ชนิดถูกพบใหม่ และ 1 ชนิดเคยมีรายงานแล้ว) ในการศึกษาครั้งนี้พบว่า SNP ชนิดที่เคยถูกรายงานแล้วนั้น มีการถ่ายทอดไปกับโรคในครอบครัวขนาดใหญ่ที่เป็นโรค PKD1 ครอบครัวหนึ่ง (PK007) ทำให้ สามารถใช้ SNP ดังกล่าวเป็นประโยชน์ในการติดตามการถ่ายทอดโรคในสมาชิกทั้งหมดของครอบครัวนี้ได้

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Pa-thai Yenchitsomanus

Role: Thesis Advisors

Created: 2004

Modified: 2553-04-26

Issued: 2010-02-02

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740444237

CallNumber: TH D812a 2004

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Immunology

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4237439.pdf	3.02 MB	27	2019-08-07 18:01:41

ใช้เวลา

0.413963 วินาที