Production of mouse monoclonal antibodies to HIV-1 Gag epitope‪(S)‬ by using HIV-1 CRF01_AE as immunogen

การผลิตโมโนโคลนัลแอนติบอดีจากหนูซึ่งจำเพาะต่อโปรตีนส่วนแก็กของเชื้อเอชไอวีไทป์ 1 โดยใช้เชื้อเอชไอวีไทป์ 1 CRF01_AE เป็นอิมมูโนเจน

Name: Phisanu Pooruk

MeSH: Antibodies, Monoclonal

MeSH: Epitopes

MeSH: Gene Products, gag

MeSH: HIV-1

Abstract: The present study aimed to establish the mouse hybridoma cell lines which secreted MAbs specific to HIV-1/Gag epitope(s) by using somatic hybridoma technique. Suspension of HIV-1 CRF01_AE strain DA5 inactivated with either formaldehyde or Nonidet P40 was used as the immunogen. Each immunizing dose was composed of approximately 40,000 TCID50 of HIV-1, with contained p24 antigen concentration of 9 ng. Immunization was done by 4 intraperitoneal injections followed by one intravenous injection at 2 week-intervals. Splenocytes from the immunized BALB/c mice were allowed to fuse with the nonsecreting myeloma cells designated P3X63-Ag 8.653. Screening for HIV-specific MAbs was performed by commercial ELISA (Organon Teknika), and immunofluorescence (IF) test involving HIV-1 infected H9 cells as the test antigens. Then, these hybrids were further screened for specificity to Gag protein by commercial western blot (WB) and by IF using TK cells infected with HIV-1 gag A/vaccinia recombinant as the antigen. Seven MAb secreting clones which were specific to Gag protein have been established. All of them were originated from mice immunized with formaldehyde treated viruses. Isotypic characterization demonstrated that all seven MAbs had IgM isotype with kappa light chain characteristic. Two clones: F-1-8C1-E4C12 and F-2-8C12-H3-H3 derived from different origins were selected for larger scale production, and then, concentrated by ammonium sulfate precipitation or IgM affinity chromatography. Specificity of these concentrated MAbs was reconfirmed by commercial ELISA, IF and dot blot using refolded recombinant Gag protein as the antigen. Collective information from all immunological tests revealed that the two MAbs possessed the following properties: 1) cross reacted with subtype A (as tested against HIV-1 gag A/vaccinia recombinant) and to subtype B viruses (as tested by commercial ELISA Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. and Murex Biotech Limited); 2) reacted with conformational epitope(s) of Gag protein. Further characterization and application of these two MAbs in HIV research are to be further investigated

Abstract: การศึกษาในครั้งนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อสร้าง hybridoma clones จากหนูซึ่งจะทำการผลิต โมโนโคลนัล แอนติบอดี (MAb) ที่จำเพาะต่อ HIV-1/Gag epitope(s) ด้วยวิธี somatic hybridoma technique อิมมูโนเจนที่ใช้ใน การฉีดหนูเตรียมจากเชื้อเอชไอวีไทป์ 1 CRF01_AE สายพันธุ์ DA5 ซึ่งถูกทำลายความสามารถในการติดเชื้อ โดย ใช้ฟอร์มัลดีไฮด์ หรือ NP40 แต่ละโด๊สของอิมมูโนเจน ประกอบด้วยเชื้อไวรัส ประมาณ 40,000 TCID50 และมี ความเข้มข้นของ p24 Ag เท่ากับ 9 นาโนกรัม หนู BALB/c จะถูกฉีดด้วยอิมมูโนเจนจำนวน 5 ครั้ง โดยฉีดเข้า ทางช่องท้อง 4 ครั้ง และฉีดเข้าหลอดเลือดอีก 1 ครั้ง ในช่วงเวลาห่างกันครั้งละ 2 สัปดาห์ จากนั้นนำเซลล์ม้าม ของหนูมา เชื่อม (fuse) เข้ากับ nonsecreting myeloma cells ชื่อ P3X63-Ag8.653 การเชื่อมต่อกันของเซลล์สอง ชนิดนี้จะทำให้เกิดเป็นเซลล์ลูกผสม (hybrid cells) น้ำเลี้ยงเซลล์จาก hybrid cells ที่เกิดขึ้นจะถูกนำไปตรวจคัดเลือกหาแอนติบอดีที่จำเพาะต่อเชื้อเอชไอวี-1 โดยใช้วิธีอีไลซ่าของบริษัท Organon Teknika และ วิธีอิมมูนเรืองแสง ซึ่งใช้ H9 cells ที่ติดเชื้อ CRF01_AE สาย พันธุ์ DA5 เป็นแอนติเจนในการทดสอบ จากนั้น hybrid cells ที่ผลิตโมโนโคลนัลแอนติบอดีที่จำเพาะต่อเอชไอ วี-1 จะถูกนำไปตรวจหาความจำเพาะต่อโปรตีนส่วนแก็ก โดยใช้วิธี Western Blot (WB) ซึ่งเป็นชุดตรวจของ บริษัท และโดยวิธีอิมมูนเรืองแสง ซึ่งใช้ TK cells ที่ติดเชื้อ HIV-1 gag A/vaccinia recombinant เป็นแอนติเจน จากผลการทดลองครั้งนี้ พบว่ามี 7 clones ที่ผลิตโมโนโคลนัลแอนติบอดี ซึ่งจำเพาะต่อโปรตีนส่วนแก็ก โดยทั้ง 7 clones มีแหล่งกำเนิดจากหนูซึ่งถูกฉีดด้วยไวรัสซึ่งถูกทำลายความสามารถในการติดเชื้อด้วยฟอร์มัลดี ไฮด์ จากนั้นนำโมเลกุลของโมโนโคลนัลแอนติบอดีที่ได้ไปศึกษาลักษณะโดยละเอียด ซึ่งพบว่า ทั้ง 7 clones ผลิ ตโมโนโคลนัลแอนติบอดีชนิด IgM และมี light chain ชนิด kappa Clone 2 clones ที่มาจากต้นกำเนิดต่างกัน คือ F-1-8C1-E4-C12 และ F-2-8C12-H3-H3 ถูกเลือกมาเพาะเลี้ยง ให้ได้จำนวนมากๆแล้วนำน้ำเลี้ยงเซลล์ไปทำให้เข้มข้นโดยการตกตะกอนด้วยแอมโมเนียมซัลเฟตและวิธีผ่าน คอลัมน์ IgM affinity chromatography จากนั้น นำโมโนโคลนัลแอนติบอดีที่เข้มข้นไปทดสอบความจำเพาะซ้ำ ใหม่อีกครั้งโดยใช้น้ำยา ELISA ของบริษัท Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. และ Murex Biotech Limited, วิธีอิม มูนเรืองแสงและวิธี dot blot ซึ่งใช้โปรตีนแก็กสังเคราะห์ (refolded recombinant Gag protein) เป็นแอนติเจน โดยอาศัยข้อมูลจากวิธีการทดสอบทางอิมมูนทั้งหมด ทำให้ทราบว่าโมโนโคลนัลแอนติบอดีที่ผลิตได้จากทั้ง 2 clones นั้นมีคุณสมบัติดังนี้ คือ 1) สามารถทำปฏิกิริยาข้ามกับ HIV-1 subtype A และ B; 2) ทำปฏิกิริยากับ conformational epitope(s) ของ โปรตีนแก็ก และผู้วิจัยจะได้นำโมโนโคลนัลแอนติบอดีที่ผลิตได้ทั้งสองนี้ไป ประยุกต์ใช้ในงานศึกษาวิจัยต่างๆต่อไปในอนาคต

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Pilaipan Puthavathana

Role: Thesis Advisors

Created: 2003

Modified: 2553-03-05

Issued: 2010-01-07

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740440002

CallNumber: TH P573p 2003

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Microbiology

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4337140.pdf	2.04 MB	9	2018-05-29 02:11:01

ใช้เวลา

0.312506 วินาที