Introduction of green fluorescent protein ‪(GFP)‬ gene into Burkholderia pseudomallei using conjugation technique

การนำยีนของโปรตีนเรืองแสงเข้าสู่เชื้อ Burkholderia pseudomallei โดยวิธีคอนจูเกชั่น

Name: Sivapong Sungpradit

MeSH: Burkholderia psudomallei

MeSH: Conjugation, Genetic

MeSH: Fluorescent Antibody Technique

Abstract: Burkholderia pseudomallei, a saprophytic gram negative bacillus is the causative agent of melioidosis. Melioidosis is an infectious disease endemic in Southeast Asia and Northern Australia. In soil isolate, there are two biotypes of this organism which are classified by the ability to assimilate L-arabinose (Ara+ and Ara-). Little is known about the behavior, pathogenicity and host-parasite interaction of this organism. In order to prepare a labelling/detection system for following the bacteria in the experimental environment or tissue sample, B. pseudomallei which intrinsically expresses a fluorescent signal, was created by introducing a green fluorescent protein (gfp) into the bacteria. The gfp gene from E. coli SM10lpir/pUTgfp2 was introduced into B. pseudomallei isolate S95019 (Ara+ biotype) using conjugation technique and selected by the Ampicillin-Chloramphenicol-Kanamycin antibiotic media. The conjugation efficiency is about 2.3x10-6 transconjugants per recipient cells. The transconjugant B. pseudomallei S95019::gfp2 cells could express a fluorescent signal and the intensity increased when the culture was left for 48 hours compared with a 24 hour culture. The new set of primer (gfp309L, gfp649R) was designed to amplify gfp genes from the transconjugant cells and nucleotide sequencing was performed. Multiplex PCR which amplified 16s ribosomal RNA (rRNA) genes confirmed that this organism is Ara+ B. pseudomallei. This fluorescent B. pseudomallei S95019::gfp2 cells may be useful for studying the behavior, pathogenicity and host-parasite interaction of this organism and in the in vivo system.

Abstract: Burkholderia pseudomallei เป็นเชื้อแบคทีเรียกรัมลบ รูปแท่ง พบในดิน เชื้อนี้เป็นสาเหตุของโรคเมลิออยโดสิส ซึ่งเป็นโรคติดเชื้อที่มีการระบาดในภูมิภาคเอเชียตะวันออกเฉียงใต้และทางตอนเหนือของทวีปออสเตรเลีย เชื้อนี้แบ่งได้เป็น 2 ชนิด คือชนิดที่สามารถใช้น้ำตาลแอล-อะราบิโนส (Ara+) และชนิดที่ไม่สามารถใช้น้ำตาลแอล-อะราบิโนส (Ara-) ซึ่งยังไม่ทราบแน่ชัดเกี่ยวกับความเป็นอยู่ของเชื้อ กลไกการก่อโรค และการปฏิสัมพันธ์ระหว่างเชื้อนี้กับคน การทำให้เชื้อนี้เรืองแสงจะเป็นประโยชน์ต่อการศึกษา โดยเฉพาะการตรวจหาเชื้อในอวัยวะต่างๆที่เชื้อเข้าไปอยู่และในสภาพสิ่งแวดล้อมที่จำลองขึ้น ในการศึกษานี้ได้นำยีนของโปรตีนเรืองแสง (gfp) ที่อยู่ในเชื้อแบคทีเรีย E. coli สายพันธุ์ SM10 (lambda) pir เข้าไปในเชื่อ B. pseudomallei สายพันธุ์ S95019 ซึ่งเป็นชนิดที่สามารถใช้น้ำตาลแอล-อะราบิโนส โดยวิธีคอนจูเกชั่น แล้วทำการคัดเลือกโคลนที่มียีนของโปรตีนเรืองแสง โดยใช้อาหารเลี้ยงเชื้อที่มียาปฏิชีวนะแอมพิซิลลิน, คลอแรมเฟนิคอลและกานามัยซิน จากการคำนวณประสิทธิภาพของการคอนจูเกชั่นมีค่าประมาณ 2.3x10 [ยกกำลัง -6] เชื้อเรืองแสง B. pseudomallei สายพันธุ์ S95019 ที่ถูกเลี้ยงไว้นาน 48 ชั่วโมงให้การเรืองแสงเพิ่มขึ้น เปรียบเทียบกับเชื้อที่เลี้ยงไว้นาน 24 ชั่วโมง เมื่อดูด้วยกล้องฟลูออเรสเซนต์ การยืนยันว่าเชื้อที่เรืองแสงเป็นเชื้อ B. pseudomallei สายพันธุ์ S95019 ใช้วิธี polymerase chain reaction โดยใช้ primer ที่จำเพาะ สำหรับเพิ่มจำนวนดีเอ็นเอของยีน gfp และ 16s rRNA เชื้อ B. pseudomallei สายพันธุ์ S95019 ที่เรืองแสงนี้จะเป็นประโยชน์ในการศึกษาความเป็นอยู่ของเชื้อ กลไกการก่อโรคและการปฏิสัมพันธ์ระหว่างเชื้อนี้ในคนหรือในสิ่งแวดล้อมจำลอง

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Sirirurg Songsivilai

Role: Thesis Advisors

Created: 2003

Modified: 2553-01-26

Issued: 2009-11-30

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740432263

CallNumber: TH S624i 2003

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Immunology

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4336546.pdf	783.73 KB	27	2020-11-08 10:40:27

ใช้เวลา

0.279372 วินาที