Competitive inhibition of the dengue virus type 2 NS3 serine protease by synthetic peptides derived from the viral polyprotein and generation of in silico model for substrate binding

การยับยั้งแบบแข่งขันของเอนไซม์โปรตีเอส NS3 จากเชื้อไวรัสเดงกี้ซีโรไทป์ 2 โดยเปปไตท์สังเคราะห์ที่ดังแปลงมาจากโปรตีนสายยาวของไวรัสและการสร้างแบบจำลองในคอมพิวเตอร์สำหรับการจับของซับสเตรทกับเอนไซม์

Name: Santad Chanprapaph

MeSH: Viral Nonstructural Proteins

MeSH: Dengue Virus

MeSH: Serine Endopeptidases

Abstract: The 69-kDa NS3 protein of dengue virus contains multiple enzymatic activities including a serine protease domain in the N-terminal region. The protease mediates cleavage at dibasic sites within the nonstructural region of the viral polyprotein and represents a promising target for antiviral drug design. Previous studies with the hepatitis C protease revealed an unusual sensitivity of this enzyme to competitive inhibition by product peptides representing cleavage sites which was subsequently exploited for the design of inhibitors with potencies in the nanomolar range. In this thesis it was demonstrated that synthetic peptides derived from the dengue type 2 polyprotein act as inhibitors of the NS3 protease with high molecular affinities. Kinetic analysis of substrate conversion experiments with the synthetic peptide substrate GRR-AMC by double reciprocal Lineweaver-Burkes plots or Dixon plots supports an inhibition mechanism which is compatible with competitive inhibitor modality. Hexapeptides based on the P1-P6 regions of all 4 cleavage sites were inhibitors with Ki - values ranging from 12-67 μM and the peptide RTSKKR base on the NS2A/NS2B site was the most efficient compound. In contrast to the HCV protease, the hexapeptide based on the intramolecular NS2B/NS3 cleavage site gave significant inhibition with a Ki of 67 μM. Shorter peptides such as SKKR, KKR, GKR and KR displayed Ki - values between 22 and 188 μM, whereas the peptide AGRR was inactive at 1 mM concentration. Consistent with an almost negligible contribution of S′ subsite binding to enzyme inhibition, pentapeptides representing the 4 nonstructural prime site sequences had no effect at 1 mM concentration. In conclusion, the data are largely compatible with binding preferences of the NS3 protease for basic residues at the P1-P4 positions, additional aliphatic and/or basic residues at P5 and P6 and small chain residues (Gly or Ser) at P1′. Data for docked energy and binding geometries obtained by molecular docking using the programs Autodock of a series of 27 peptides to a homology-based model of the dengue virus NS2B(H)-NS3p suggests that binding is more favourable in the presence of the NS2B cofactor and that binding of product peptides is similar to ground-state binding of corresponding substrates. In summary, it is shown for the first time that the dengue virus NS3 protease shares competitive inhibition by product peptides with its HCV counterpart. These results offer the prospect of developing potent inhibitors against the dengue virus NS3 protease by combinatorial optimization and peptidomimetic design of product inhibitors based on native polyprotein cleavage junctions."

Abstract: โปรตีน NS3 เป็นโปรตีนที่มิใช่ส่วนประกอบทางโครงสร้างของเชื้อไวรัสเดงกี้ซึ่งมีขนาดประมาณ 39 กิโลดาลตัน ประกอบด้วยส่วนที่มีหน้าที่เป็นเอนไซม์ชนิดต่างๆรวมถึงเอนไซม์เซอรรีนโปรตีเอสซึ่งอยู่บริเวณปลายด้านอะมิโน เอนไซม์โปรตีเอสจะตัดส่วนของโปรตีนตั้งต้นของเชื้อไวรัสในบริเวณที่มีกรดอะมิโนชนิดที่เป็นด่างซึ่งเรียงต่อกัน 2 ตัวที่อยู่ภายในบริเวณที่เป็นโปรตีนที่มิใช่ส่วนประกอบทางโครงสร้าง และเอนไซม์โปรตีเอสยังเป็นเป้าหมายที่สำคัญสำหรับการออกแบบยาต้านเชื้อไวรัสด้วย จากการศึกษาเอนไซม์โปรตีเอสของเชื้อไวรัสตับอักเสบชนิดบีที่ผ่านมา ได้เปิดเผยถึงความไวที่ผิดปกติของเอนไซม์นี้ในการยับยั้งแบบแข่งขันต่อเปปไตท์ที่ได้จากการตัดที่ตำแหน่งของการตัดตามธรรมชาติของเอนไซม์ ซึ่งต่อมาเปปไตท์นี้ได้นำมาใช้ในการออกแบบตัวยับยั้งเอนไซม์ที่มีความแรงในระดับนาโนโมลาร์ ในการศึกษานี้ได้แสดงให้เห็นว่าเปปไตท์ที่ได้จากการสังเคราะห์ซึ่งมาจากโปรตีนตั้งต้นของเชื้อไวรัสเดงกี้ซีโรไทป์ 2 มีฤทธิ์เป็นตัวยับยั้งเอนไซม์โปรตีเอส NS3 โดยสามารถจับกับเอนไซม์ได้ดี การวิเคราะห์ทางจลนศาสตร์ของการเปลี่ยนแปลงของซับสเตรท GRR-AMC ที่ได้จาการสังเคราะห์โดยใช้ double reciprocal Lineweaver-Burkes plots or Dixon plots สนับสนุนว่ากลไกของการยับยั้งเป็นแบบแข่งขัน เฮกซะเปปไตท์ที่ประกอบด้วยกรดอะมิโนจากตำแหน่ง P1 ถึง P6 ซึ่งได้มาจากการตัดโปรตีนสายยาว 4 ตำแหน่งที่ต่างกันโดยเอนไซม์ มีฤทธิ์เป็นตัวยับยั้งเอนไซม์ซึ่งมีค่า Ki อยู่ระหว่าง 12 ถึง 67 ไมโครโมลาร์ และเปปไตด์ RTSKKR ที่มาจากตำแหน่งของการตัดระหว่างโปรตีน NS2A และโปรตีน NS2B มีฤทธิ์ในการเป็นตัวยับยั้งที่ดีที่สุด ตรงข้ามกับเอนไซม์โปรตีเอสของเชื้อไวรัสตับอักเสบชนิดบีเฮกซะเปปไตท์ที่มาจากตำแหน่งของการตัดระหว่างโปรตีน NS2B และโปรตีน NS3 สามารถยับยั้งเอนไซม์ได้อย่างมีนัยสำคัญ โดยมีค่า Ki 67 ไมโครโมลาร์ เปปไตท์สายที่สั้นลงเช่น SKKR, KKR, GRK และ KR มีค่า Ki อยู่ระหว่าง 22 ถึง 188 ไมโครโมลาร์ ในขณะที่เปปไตท์ AGRR ไม่มีฤทธิ์ในการยับยั้งเอนไซม์ในระดับความเข้มข้น 1 มิลลิโมลาร์เพนตะเปปไตท์ที่ประกอบด้วยกรดอะมิโนในตำแหน่งทางด้าน prime site จากการตัดโปรตีนสายยาว 4 ตำแหน่งที่ต่างกันไม่มีฤทธิ์ในการยับยั้งเอนไซม์ในระดับความเข้มข้น 1 มิลลิโมลาร์ โดยสรุป ข้อมูลที่ได้บ่งชี้ถึงความชอบของเอนไซม์โปรตีเอส NS3 ในการจับกับเปปไตท์ที่มีกรดอะมิโนชนิดที่เป็นด่างในตำแหน่ง P1 ถึง P4 กรดอะมิโนชนิดที่เป็น aliphatic และ/หรือชนิดที่เป็นด่าง ในตำแหน่ง P5 ถึง P6 และ กรดอะมิโนที่มีขนาดเล็ก (Gly หรือ Ser) ที่ตำแหน่ง P1′ ข้อมูลทั้ง docked energy และ binding geometry ที่ได้จากการทำ molecular docking ของเปปไตท์ 27 ตัวกับแบบจำลองของเอนไซม์สายเดี่ยวเชิงซ้อน NS2B(H)-NS3p ของเชื้อไวรัสเดงกี้ โดยใช้โปรแกรม AutoDock เสนอแนะว่าการจับกับเอนไซม์จะดีขึ้นเมื่อมี NS2B cofactor และการจับของเปปไตท์ที่ได้จากการตัดคล้ายกับการจับของซับสเตรทซึ่งสัมพันธ์กัน การศึกษานี้แสดงให้เห็นเป็นครั้งแรกว่าเปปไตท์ที่ได้จากการตัดสามารถยับยั้งเอนไซม์โปรตีเอส NS3 ของเชื้อไวรัสเดงกี้ เช่นเดียวกับที่พบในเอนไซม์โปรตีเอสของเชื้อไวรัสตับอักเสบชนิดบี ผลงานวิจัยนี้สามารถนำมาใช้สำหรับการพัฒนาตัวยับยั้งที่มีความแรงต่อเอนไซม์โปรตีเอส NS3 ของเชื้อไวรัสเดงกี้โดยการทำ combinatorial optimization และการออกแบบตัวยับยั้งประเภท peptidomimetic โดยอยู่บนพื้นฐานของตำแหน่งที่เกิดการตัดตามธรรมชาติของโปรตีนสายยาว

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Gerd Katzenmeier

Role: Thesis Advisors

Created: 2009-07-09

Modified: 2020-04-19

Issued: 2009-07-09

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740463894

CallNumber: TH S197c 2005

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Molecular Genetics and Genetic Engineering

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4436418.pdf	3.03 MB	43	2022-03-03 21:19:18

ใช้เวลา

-0.589053 วินาที