Utilization of microbial resources from Myanmar traditional fermented tea (Laphet-so)

การใช้ประโยชน์ของทรัพยากรจุลินทรีย์จากชาหมักท้องถิ่น (ลาเพ็ท-โซ) ของประเทศเมียนมาร์

Name: Nang Nwet Noon Kham

LCSH: Laphet-so

LCSH: Tea

LCSH: Microorganisms

Abstract: From nine samples of Laphet-so, a total of seventy four bacterial isolates and twenty nine yeast isolates were achieved. It was found that all microbial isolates exhibited significant production of indoles plant hormone due to the screening assay. The bacterial isolates H10 (359.81 ± 0.03 µg/mL) and H14 (365.47 ± 2.82 µg/mL) displayed the highest production of indole-related compounds among all microbial isolates. The Salkowski reagent-based IAA assay is responsive the sequential conversion of tryptophan to indolic IAA. However, the precise IAA quantification by high performance liquid chromatography (HPLC) showed that IAA concentration of 6.71 and 568.82 µg/mL were produced by the isolates H10 and H14, respectively. Through analysis of the 16S rRNA gene sequence, the isolate H14 was identified to be Klebsiella aerogenes. The influence of K. aerogenes H14 on in vitro germination of tea, tomato and sunflower seeds was investigated and it was found that the culture broth from K. aerogenes H14 exhibited a significant increase in the rate of germination, vigor index, and development of both the root and shoot compared to untreated samples of tomato and sunflower seeding, but it was failed to stimulate the tea seed germination. Further the study aims to harness the untapped potential of yeast by exploring the utilization of microbial resources found within Laphet-so. A total of eighteen isolates of thermotolerant yeasts were obtained from eight samples of Laphet-so collected from southern Shan state, Myanmar. These isolates demonstrated the tannin tolerance and six isolates were resistant to 5% (w/v) tannin concentration. All eighteen isolates were capable of carboxy-methyl cellulose (CMC) degrading and the DK isolate was only one isolate showing ethanol production at 45˚C noticed by gas formation. This ethanol producing yeast was identified to be Cyberlindnera rhodanensis through the sequence analysis of the D1/D2 domain of the LSU rRNA gene. C. rhodanensis DK produced thermostable extracellular β-glucosidase with the highest total activity 1.70 ± 0.01 U when cultured at 37˚C for 24 h using 0.5% (w/v) CMC as a carbon source. The best carbon sources for extracellular β-glucosidase production were found to be xylan and xylose, with β-glucosidase activity of 3.07-3.08 U/mL achieved when the yeast was cultivated in the yeast malt extract (YM) broth containing either 1% (w/v) xylan or xylose as a sole carbon source, at 37˚C for 48 h. The optimal medium compositions for enzyme production achieved by using Plackett-Burman design and Central Composite Design (CCD) was found to be yeast extract 5.83 g/L, peptone 10.81 g/L and xylose 20.20 g/L, resulting in a production of 7.96 U/mL, while the medium of yeast extract 5.79 g/L, peptone 13.68 g/L and xylan 20.16 g/L gave 9.45 ± 0.03 U/mL for 48 h cultivation at 37˚C. The enzyme was also exhibited remarkable stability under varying temperature conditions such as 100% stable for 3 h at 35˚C, 88% maintained for 3 h at 45˚C and 75% stable and retained for 3 h at 55˚C. The applying of C. rhodanensis DK in fermentation of a healthy alcoholic beverage using cashew apples juice (CAJ) as substrate was investigated. Optimal conditions for sugar-to-ethanol conversion were determined by conducting experiments with glucose concentrations of 5% and 10% (w/v). The ethanol conversion rate was enhanced upon adjusting the pH of CAJ to 6, and fermentation was extended over a 12-days period. To accelerate sugar consumption within 7 days, co-culture fermentation approach was employed utilizing Saccharomyces cerevisiae TISTR 5088 and Lactiplantibacillus pentosus A14-6. All yeast strains demonstrated vigorous growth, with concentrations averaging around 6.8 Log cfu/mL and pH levels ranging from 3.5 and 5.6. Total acidity levels were within the range of 0.02 ± 0.00 to 0.28 ± 0.00 M, while total sugar and reducing sugar levels remained consistent in the range of 2.0 ± 0.00 - 7.7 ± 0.00 g/L and 1.8 ± 0.001 - 6.6 ± 0.00 g/L, respectively, following mono- and co-culture fermentation. The fermented CAJ displayed ethanol contents ranging from 20.5 ± 0.06 - 48.4 ± 0.09 g/L after 7 days of fermentation. Furthermore, the presence of bioactive compounds and the antioxidant activity of the fermented product was significantly increased including total phenolic and total tannins, by a factor of 1.9 ± 0.01 - 2.0 ± 0.01 mg GAE/mL and 1.4 ± 0.04 - 1.5 ± 0.01 mg TAE/mL following the fermentation period. This increase was observed in both mono-culture C. rhodanensis DK and co-culture C. rhodanensis DK + L. pentosus A14-6. Additionally, the fermentation process involving these strains led to a notable rise in the antioxidant activity. The unfermented product initially showed the increase of antioxidant activity from 53.45 ± 0.3% to 65.05 ± 0.22% after the fermentation process. The study highlights the achievement of the highest β-glucosidase enzyme activity of 14.0 ± 0.2 mU/mL, during the co-culture fermentation of C. rhodanensis DK + L. pentosus A14-6. Furthermore, this fermentation combination received significantly high scores in aroma sensory evaluations.

Abstract: จากลาเพต-โซจำนวน 9 ตัวอย่าง สามารถแยกแบคทีเรียและยีสต์ได้ 74 และ 29 ไอโซเลต ตามลำดับ การศึกษาในเบื้องต้นพบว่าจุลินทรีย์ที่แยกได้ทั้งหมดสามารถมีการผลิตฮอร์โมนพืชกลุ่มอินโดลอย่างมีนัยสำคัญ การตรวจสอบการสร้าง IAAโดยการใช้รีเอเจนต์ของ Salkowski พบว่า แบคทีเรียที่ผลิต IAA ได้สูงสุดคือไอโซเลต H10 (359.81 ± 0.03 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) และ H14 (365.47 ± ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) อย่างไรก็ตาม การตรวจวัดปริมาณ IAA ที่แม่นยำโดยโครมาโทกราฟีของเหลวสมรรถนะสูง (HPLC) พบว่าไอโซเลต H10 และ H14 ผลิต IAA ที่ความเข้มข้น 6.71 และ 568.82 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ตามลำดับ ผลจากการวิเคราะห์ลำดับยีน 16S rRNA ทำให้จัดจำแนกไอโซเลต H14 เป็น Klebsiella aerogenes การตรวจสอบอิทธิพลของ K. aerogenes H14 ต่อการงอกในหลอดทดลองของเมล็ดชา มะเขือเทศ และทานตะวัน พบว่าน้ำเลี้ยงจาก K. aerogenes H14 สามารถเพิ่มอัตราการงอก ดัชนีความแข็งแรง และการพัฒนารากและยอด ของเมล็ดมะเขีอเทศและทานตะวันอย่างมีนัยสำคัญ เมื่อเปรียบเทียบกับการทดลองชุดควบคุม แต่ไม่สามารถกระตุ้นการงอกของเมล็ดชาได้ นอกจากนี้ การศึกษายังมุ่งเป้าหมายในการใช้ประโยชน์จากทรัพยากรจุลินทรีย์ที่พบในลาเพต-โซ สามารถแยกยีสต์ทนร้อนทั้งหมด 18 ไอโซเลตจากลาเพต-โซที่เก็บจากรัฐฉานใต้ ประเทศเมียนมาร์ จำนวน 8 ตัวอย่าง ยีสต์ที่แยกได้ทั้งหมดมีคุณสมบัติในการทนทานต่อแทนนินและพบว่ามีจำนวนยีสต์ 6 ไอโซเลตที่สามารถต้านทานต่อแทนนินความเข้มข้นสูงถึง 5% (w/v) นอกจากนี้ยีสต์ทั้ง 18 ไอโซเลตยังสามารถย่อยเจริญและสลายคาร์บอกซีเมทิลเซลลูโลส (CMC) ได้ อย่างไรก็ตามมีเพียงไอโซเลต DK ที่สามารถผลิตเอทานอลที่อุณหภูมิ 45°C ซึ่งสังเกตได้จากการสร้างก๊าซ ยีสต์ไอโซเลตที่ผลิตเอธานอลสามารถจัดจำแนกได้เป็น Cyberlindnera rhodanensis จากผลการวิเคราะห์ลำดับของโดเมน D1/D2 ของยีน LSU rRNA ยีสต์ C. rhodanensis DK ผลิต เบต้า-กลูโคซิเดสที่ทนร้อนและส่งออกมาภายนอกเซลล์นอกเซลล์ทโดยตรวจพบค่ากิจกรรมสูงสุด 1.70 ± 0.01 U เมื่อเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 24 ชั่วโมงโดยใช้ CMC 0.5% (w/v) เป็นแหล่งคาร์บอน แหล่งคาร์บอนที่ดีที่สุดสำหรับการผลิตเบต้า-กลูโคซิเดสคือไซแลนและไซโลส โดยมีค่ากิจกรรมที่ 3.07-3.08 U/mL เมื่อเพาะเลี้ยงในอาหารเหลว YM ที่มี 1% (w/v) ไซแลนหรือไซโลสเป็นแหล่งคาร์บอนเพียงแหล่งเดียว ที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 48 ชั่วโมง อาหารที่เหมาะสมสำหรับการผลิตเอนไซม์โดยการออกแบบโดยใช้แผนการทดลองทางสถิติ Plackett-Burman design (PBD) และ Central Composite Design (CCD) ประกอบด้วย สารสกัดจากยีสต์ 5.83 กรัม/ลิตร เพปโตน 10.81 กรัม/ลิตร และไซโลส 20.20 กรัม/ลิตร ทำให้ได้ผลผลิตเอนไซม์ 7.96 U/mL ในขณะที่ส่วนประกอบของอาหารที่ประกอบด้วยยีสต์สกัด 5.79 g/L เพปโตน 13.68 g/L และไซแลน 20.16 g/L ให้ค่ากิจกรรม 9.45 ± 0.03 U/mL จากการเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 48 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 37°C เบต้า-กลูโคซิเดสที่ผลิตโดย C. rhodanensis DK ยังแสดงความเสถียรภายใต้สภาวะอุณหภูมิที่แตกต่างกัน เช่น 100% เสถียร จากการบ่มเป็นเวลา 3 ชั่วโมงที่ 35°C, คงสภาพ 88% จากการบ่ม 3 ชั่วโมงที่ 45°C และ คงสภาพที่ 75% เป็นเวลา 3 ชั่วโมงที่ 55°C การศึกษาการใช้ C. rhodanensis DK ในการหมักเครื่องดื่มแอลกอฮอล์เพื่อสุขภาพโดยใช้น้ำมะม่วงหิมพานต์ (CAJ) เป็นวัตถุดิบตั้งต้น การศึกษาสภาวะที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการเปลี่ยนน้ำตาลไปเป็นเอทานอลที่ความเข้มข้นของกลูโคส 5% และ 10% (w/v) พบว่าอัตราการเปลี่ยนน้ำตาลเป็นเอธานอลเพิ่มขึ้นเมื่อปรับค่า pH ของ CAJ เป็น 6 และระยะเวลาที่ใช้ในการหมักจะขยายออกไปเป็นเวลา 12 วัน การพยายามลดระยะเวลาของการหมักเพื่อเร่งการใช้น้ำตาลภายใน 7 วัน โดยการใช้การหมักร่วมระหว่าง Saccharomyces cerevisiae TISTR 5088 และ Lactiplantibacillus pentosus A14-6 ยีสต์ทุกสายพันธุ์มีการเจริญที่ดี โดยมีปริมาณเซลล์ประมาณ 6.8 Log cfu/mL และระดับ pH อยู่ในช่วงตั้งแต่ 3.5 และ 5.6 ระดับความเป็นกรดรวมอยู่ในช่วง 0.02 ± 0.00 ถึง 0.28 ± 0.00 M ขณะที่ระดับน้ำตาลรวมและน้ำตาลรีดิวซ์ยังคงสม่ำเสมอในช่วง 2.0 ± 0.00 - 7.7 ± 0.00 กรัม/ลิตร และ 1.8 ± 0.001 - 6.6 ± 0.00 กรัม/ L ตามลำดับ ผลการหมักน้ำมะม่วงหิมพานต์แบบเชื้อเดี่ยวและแบบเชื้อผสม เป็นเวลา 7 วัน ตรวจพบปริมาณเอธานอลอยู่ในช่วง 20.5 ± 0.06 - 48.4 ± 0.09 กรัม/ลิตร นอกจากนี้ ตรวจพบการเพิ่มขึ้นของสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพและฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของผลิตภัณฑ์หมักอย่างมีนัยสำคัญ รวมไปถึงปริมาณสารฟีนอลิกทั้งหมดและแทนนินทั้งหมดที่พบในช่วง 1.9 ± 0.01 - 2.0 ± 0.01 มก. GAE/มล. และ 1.4 ± 0.04 - 1.5 ± 0.01 มก. TAE /มล. ตามระยะเวลาการหมัก โดยพบการเพิ่มทั้งใน C. rhodanensis DK ที่เพาะเลี้ยงแบบเชื้อเดี่ยว และ C. rhodanensis DK + L. pentosus A14-6 ที่เพาะเลี้ยงแบบเชื้อผสม นอกจากนี้ กระบวนการหมักที่เกี่ยวข้องกับจุลินทรีย์ที่ศึกษาเหล่านี้ยังตรวจพบการเพิ่มขึ้นของกิจกรรมต้านอนุมูลอิสระอย่างเห็นได้ชัด จาก 53.45 ± 0.3% เป็น 65.05 ± 0.22% หลังจากกระบวนการหมัก ผลการศึกษาแสดงให้เห็นการทำงานของเอนไซม์เบต้า-กลูโคซิเดสที่ตรวจพบได้สูงสุด14.0 ± 0.2 mU/mL ในระหว่างการหมักแบบเพาะเลี้ยงแบบเชื้อผสม นอกจากนี้ ผลิตภัณฑ์ที่ได้จากการหมักแบบเชื้อผสมยังได้รับคะแนนสูงอย่างมีนัยสำคัญในการประเมินทางประสาทสัมผัสด้านกลิ่น

Chiang Mai University. Library

Address: CHIANG MAI

Email: cmulibref@cmu.ac.th

Name: Chartchai Khanongnuch

Role: Advisor

Name: Saisamorn Lumyong

Role: Advisor

Name: Chalermpong Saenjum

Role: Advisor

Name: Apinun Kanpiengjai

Role: Advisor

Name: Kridsada Unban

Role: Advisor

Created: 2023

Modified: 2024-01-06

Issued: 2023-10-30

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Biotechnology

Grantor: Chiang Mai University

©copyrights Chiang Mai University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	629951001.pdf	10.35 MB	1	2024-01-05 13:46:02

ใช้เวลา

0.050357 วินาที