Dengue virus and the capability to infect human Megakaryocyte from Megakaryoblastic cell line and Hematopoietic stem cell

ความสามารถในการติดเชื้อของเดงกี้ไวรัสต่อเซลล์เมกาคารีโอไซต์ที่มาจากเซลล์ไลน์เมกาคารีโอบลาสและเซลล์ต้นกำเนิดเลือด

Name: Nattapol Attatippaholkun

LCSH: Dengue Virus

LCSH: Dengue viruses -- Laboratory manuals

MeSH: Thrombocytopenia

MeSH: Flow Cytometry

MeSH: Stem Cells

MeSH: Megakaryocytes

Abstract: The issue of whether dengue viruses (DENV) infect human megakaryocytes or platelet factories impairing platelet production to promote platelet depletion has been controversial. To clearly answer this question, the first objective was to use flow cytometry analyzing the surface markers of megakaryocyte (CD41 and CD42b) and intracellular DENV simultaneously, however, the obstacle was that there was no commercially available direct conjugated fluorochrome-anti DENV monoclonal antibody (mAb). To overcome this, the study used a commercial LYNX Rapid Conjugation Kits® to directly conjugate phycoerythrin to a commercial anti DENV mAb. Flow cytometry analysis showed that the conjugated mAb established in this study could detect intracellular DENV inside Vero cells. This antibody and megakaryocyte-specific antibody could also simultaneously detect the surface markers of megakaryocyte and intracellular DENV using megakaryoblastic cell line, MEG-01 cells, as a model. Fluorescence microscopy analysis further confirmed the binding sites of each mAb. Strikingly, the method demonstrated a specific pattern of infection in CD42b+ MEG-01 cells. RT-PCR and an apoptosis assay also showed that DENV could replicate itself to release new viral progenies from MEG-01 cells and induce MEG-01 cell apoptosis. The second objective was to investigate the infection in human megakaryocytes, however, limitation of all previous reports had been the difficulty in obtaining sufficient numbers of megakaryocytes. To overcome this, in vitro cultures of cytokines-induced megakaryocytes from hematopoietic stem cells were performed. Large numbers and various stages of early, intermediate and mature megakaryocytes could successfully be produced. Unlike MEG-01 cells, however, DENV could not infect cytokines-induced megakaryocytes in the condition used in this study. The condition needed to be further optimized to suit DENV infection in these cells. In summary, the method for direct conjugating fluorochrome to mAb could be applied in investigating the infectivity of any particular viruses in any specific cell types via flow cytometry and fluorescence microscopy.

Abstract: ปัจจุบันยังไม่มีคำตอบที่แน่ชัดของคำถามที่ว่าจริงหรือไม่ที่ภาวะเกล็ดเลือดต่ำในคนไข้เดงกี่เกิด จากเมกาคารีโอไซต์หรือเซลล์ที่สร้างเกล็ดเลือดติดเชื้อเดงกี่ไวรัสทำให้การสร้างเกล็ดเลือดลดลง เพื่อที่จะตอบคำถามนี้ เป้าหมายแรกของงานวิจัยคือการใช้เครื่องโฟล์วไซโตเมทรีวิเคราะห์โปรตีนที่บ่งชี้ความเป็นเมกาคารีโอไซต์ซึ่งอยู่บนผิวเซลล์และเดงกี่ไวรัสซึ่งอยู่ภายในเซลล์โดยพร้อมกัน แต่อุปสรรคหลักคือแอนติบอดีต่อเดงกี่ไวรัสที่มีสีฟลูออเรสเซนต์ผูกติดไม่มีขายในท้องตลาด เพื่อที่จะก้าวข้ามอุปสรรคงานวิจัยนี้ใช้ LYNX Rapid Conjugation Kits® ผูกสีฟลูออเรสเซนต์ติดกับแอนติบอดีต่อเดงกี่ไวรัส การวิเคราะห์ด้วยเครื่องโฟล์วไซโตเมทรีแสดงให้เห็นว่า แอนตีบอดี้ที่พัฒนาขึ้นในงานวิจัยนี้สามารถตรวจจับเดงกี่ไวรัสในเวโรเซลล์ แอนติบอดีนี้และ แอนติบอดีจำเพาะต่อเมกาคารีโอไซต์ยังสามารถตรวจจับโปรตีนที่บ่งชี้ความเป็นเมกาคารีโอไซต์ (CD41 และ CD42b) และเดงกี่ไวรัสโดยพร้อมกันโดยใช้เซลล์ไลน์ เมกาคารีโอบลาส (เซลล์MEG-01) ในการทดลองการวิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบตรวจจับการเรืองแสงของสีฟลูออเรสเซนต์ยืนยันตำแหน่งของแอนติบอดีว่าอยู่ที่ผิวหรือภายในเซลล์ งานวิจัยนี้ยังแสดงให้เห็นถึงการติดเชื้อของเดงกี่ไวรัสแบบจำเพาะต่อเซลล์ที่มี CD42b อยู่บน ผิวเซลล์ RT-PCR และการทดสอบ apoptosis ยังแสดงให้เห็นว่าเดงกี่ไวรัสสามารถเพิ่มจำนวนและผลิตลูกหลานออกมาจากเซลล์ MEG-01และ ทำให้เซลล์ MEG-01 apoptosis เป้าหมายที่สองคือการทดลองติดเชื้อเดงกี่ไวรัสในเมกาคารีโอไซต์ที่มา จากมนุษย์ แต่อุปสรรคหลักคือเป็นเรื่องที่ยากมากที่จะนำเมกาคารีโอไซต์มาทำการทดลองได้อย่างเพียงพอ เพื่อที่จะก้าวข้ามอุปสรรคงานวิจัยได้ผลิตเมกาคารีโอไซต์จากเซลล์ต้นกำเนิดในหลอดทดลองเมกาคารีโอไซต์ทั้งแบบตัวอ่อนถึงตัวแก่จำนวนมากถูกผลิตขึ้นเป็นผลสำเร็จ แต่ยังไม่สามารถหาสภาวะที่เหมาะสม ที่จะแสดงการถูกติดเชื้อโดยเดงกี่ไวรัสได้ภายใต้วิธีการทดลองในงานวิจัยนี้สภาวะจะต้องถูกปรับต่อไปเพื่อ ให้เดงกี่ไวรัสติดเชื้อได้ในเซลล์ชนิดนี้ โดยสรุปแล้วความสำเร็จของวิธีการผูกสีฟลูออเรสเซนต์ติดกับแอนติบอดีสามารถต่อยอดไปใช้ศึกษาการติดเชื้อของไวรัสตัวอื่นในเซลล์ที่มีโปรตีนบ่งชี้โดยวิเคราะห์ด้วยเครื่องโฟล์วไซโตเมทรีและกล้องจุลทรรศน์แบบตรวจับการเรืองแสงของสีฟลูออเรสเซนต์

Mahidol University. Mahidol University Library and Knowledge Center

Address: NAKHONPATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Surapol Issaragrisil

Role: Thesis Advisors

Name: Kovit Pattanapanyasat

Role: Thesis Advisors

Name: Chanchao Lorthongpanich

Role: Thesis Advisors

Created: 2016

Modified: 2566-06-01

Issued: 2023-05-31

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Molecular Medicine

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	5001086.pdf	12.99 MB	2	2024-11-08 14:01:45

ใช้เวลา

0.288457 วินาที